在《火影忍者》中，大蛇丸*害三代目火影是在第79集。
大蛇丸和三代目火影猿飞日斩之间的关系复杂。大蛇丸曾经是三代目火影的得意门生，但在研究禁术和人体实验的问题上，两人产生了严重的分歧。大蛇丸因此离开了木叶村，并继续进行他的实验。
在一段时间后，大蛇丸为了发动“木叶崩溃计划”，与四代风影合作进攻木叶。但在进攻过程中，大蛇丸中途击*了四代风影，并化身为风影与猿飞日斩战斗。这场战斗对整个忍者世界产生了重大影响，因为这已经不是简单的个人矛盾，而是相当于风之国对火之国的战争。
在战斗中，大蛇丸展现了他的研究成果，包括柱间细胞、写轮眼移植和秽土转生等。这些研究成功让大蛇丸变得非常强大，但他也因此更加怨恨他的老师猿飞日斩。他向猿飞炫耀自己的研究成果，反而促使猿飞下定决心要*掉大蛇丸。
