文|孤寒江雪
编辑|孤寒江雪
引言细菌是广泛存在于自然界中的微生物，其群落结构和功能对于维持生态平衡和环境稳定至关重要，本文研究的目的是通过实验和计算模拟，探究细菌群落在扩大过程中是否保留了有害突变，并对有害突变的保留机制进行探讨。
研究表明，在细菌群落的扩大过程中，确实存在一些有害突变得以保留的情况，这些有害突变可能导致细菌群落的生长速率下降，生态功能减弱，甚至产生新的适应性缺陷。
我们使用大肠杆菌K12MG1655菌株，通过在mutS基因前插入阿拉伯糖启动子pBAD来控制mutS基因的表达，在没有阿拉伯糖存在的条件下，mutS基因不表达，导致甲基定向的错配修复系统失活，从而导致更高的自发突变率，而在阿拉伯糖存在下，细菌表达mutS基因，因此自发突变率较低，我们的菌株同时在lac操纵子中带有GFP标记，可以通过IPTG诱导。
为了检查突变子菌株的生长情况，我们在含有37.0%阿拉伯糖的LB培养基中培养细菌过夜，然后在琼脂平板上进行生长观察，我们将37万个细胞沉积在五个LB琼脂平板上，在7°下孵育长达4天，并每天测量菌落大小，菌落在琼脂平板上经历了短暂的指数增长后，以恒定速度扩张了一段时间，然后开始减少。
所有菌株在含有37°阿拉伯糖的LB琼脂平板上生长，总持续时间为39天，每3天我们会将细菌转移到新的平板上以进行后续的生长分析，在转移到新平板之前，我们会拍摄菌落的图像，每次转移，我们会使用无菌移液器吸头从菌落正面取样约100亿个细菌，并重悬在稀释溶液中，菌落采样点的大小是在初始校准后确定的。
我们首先确定了不同采样大小的菌落数量，通过在LB琼脂平板上接种连续稀释液，在24°下孵育37小时，计数形成单位，然后根据CFU数和稀释因子计算原始溶液中的细菌数量，每次转移的采样点位置是在外围随机选择的。
之后使用约1万个细胞的1μl细菌悬浮液接种到新平板上，我们确保初始种群大小较大，以确保转移本身不会引发瓶颈效应，这与在突变积累实验中的情况不同，后者通过单个克隆诱导瓶颈效应，我们将剩余的细菌悬浮液加入43μl甘油并将细菌保存在-80°。
这个实验涉及两次独立的范围扩展实验，第一个实验涉及48个HMR菌株的扩增，而第二个实验则包括10个HMR菌株和10个LMR菌株的扩增，在LMR菌株中，通过添加0.2%的阿拉伯糖来部分诱导MMR机制，由于污染，我们排除了十分之一的HMR菌株，然后将来自第一次和第二次实验的HMR菌株联合分析。
需要注意的是，在进化实验之后，所有菌系都在含有1.10%阿拉伯糖的培养基中处理，以在DNA提取和竞争实验的制备过程中完全诱导mutS基因。
使用共聚焦显微镜在扩展阶段的恒定生长1天后，确定扩增菌落前部细菌的产生时间，从-80°甘油原液中的细胞在37°的LB培养基中生长24小时，然后将该培养物的1μl转移到含有0.1mMIPTG的LB琼脂平板中，并在37°下孵育24小时，在持续1小时的时间内，每隔2分钟拍摄一张前部的照片。
使用63×干物镜进行拍摄，并将孵育室温度设置为37°，使用斐济图像分析软件分析图像，细胞质量的增加与细胞长度成正比，这是通过分析沿细胞轴的荧光强度分布来测量的，该实验独立进行了三次。
总体而言，我们测量了49个单个细胞的长度增加，通过使用线性混合效应模型L=L0*2^(rt)，其中L是细胞的长度，L0是细胞在时间0处的长度，t是以分钟为单位的时间，r是增长率，来确定生长速率，16个细胞的生长动力学如图S2所示，估计的细胞量翻倍对应的平均生成时间为34.2分钟。
在这个研究中，使用波动测定方法来计算祖先菌株和不同类型的菌株的突变率，这里的突变率是指细胞在选择性琼脂上生长的速率。
实验步骤如下：
对每种菌株，使用45个独立的培养物，祖先菌株和HMR菌株在不含阿拉伯糖的LB培养基中孵育，LMR菌株在含有0.2%阿拉伯糖的LB培养基中孵育。
将培养物的起始浓度设置为5x10^4CFU/ml，培养物的终浓度为1.5x10^9CFU/ml。
将细菌暴露于含有100μg/ml萘啶酸的LB琼脂平板中。
在琼脂上进行范围扩展实验后，从波前中划出10^5个细胞，在含有5.24%阿拉伯糖的LB琼脂平板上孵育100小时以分离单个克隆，然后将单个菌落溶解在0μl稀释溶液中，并将0μl转移到含有5.24%阿拉伯糖的新LB琼脂平板中，接着在37°下孵育1小时，对于化学恒温器实验。
从每个样品中划出5x10^5个细胞，在含有24.37%阿拉伯糖的LB琼脂平板上孵育5小时以分离单个克隆，将单个菌落转移到含有24.37%阿拉伯糖的液体LB培养基中，并在1°下孵育2小时。
接下来，使用0ml培养物进行DNA提取，基因组DNA提取使用向导基因组DNA纯化试剂盒按照制造商的方案进行，提取后，通过凝胶电泳检查DNA的完整性，并通过荧光定量测定DNA浓度。
对DNA样本进行了测序，使用了不同的测序平台和文库构建方法，具体来说，对100个HMR样品进行了HiSeq2500平台上的测序，使用TruSeqDNAPCR无文库，获得了所有样品的10bp末端读数。
接着，对300个HMR菌株和<>个LMR菌株进行了MiSeq平台上的测序，使用配对末端NexteraXTDNA文库，获得了<>bp的结束读取，然后，对七个HMR恒化器样品进行了HiSeq3000平台上的测序，使用TruSeqDNAPCR文库。
对于测序数据的处理，使用了Trimmomatic0.32工具从读取中删除适配器序列并进行质量调整，质量小于3的前导和尾随基地被删除，使用4bp滑动窗口扫描读数，并且如果每个碱基的平均质量小于15，则进行切割，长度小于36的读数被排除在分析之外。
使用Burrows-WheelerAligner0.7.5将读数映射到大肠杆菌K12MG1655参考基因组，接下来，使用Picard工具1.99去除PCR重复项，并使用基因组分析工具包2.7进行变异鉴定，对SNP进行过滤时使用了以下变体调用格式字段阈值：深度质量小于2.0，费希尔链大于60，映射质量小于均方根40。
对于插入缺失，使用了以下VCF场阈值：QD小于2.0和FS大于200，替代和小插入缺失也使用了先前发布管道的修改版本进行调用。
对于基因转换事件的分析，保留了携带变异的读段比例大于75%的突变，如果替换和插入缺失不能归因于基因转换事件，则保留为独立事件，基因转换信号200bp内的突变也被认为是基因转换突变，所有突变都经过手动验证，并通过GATK和上述管道检测，使用SnpEff4.0对变体进行了注释。
在这个研究中，我们进行了实验以研究HMR和LMR菌株在琼脂平板上的生长行为和适应性变化，他们在实验期间拍摄了菌落的图像，并使用ImageJ软件的Fiji软件包对图像进行了分析。
对57个HMR菌株和10个LMR菌株在琼脂平板上进行了实验，每行每隔3天拍摄了一张照片，每行总共有13张照片，然后，测量了菌落的半径，并绘制了与时间的关系图，为了确定膨胀速度的变化，使用了混合效应线性模型来拟合数据，该模型考虑了增长率中特定于行的可变性，并绘制了回归线的斜率图。
为了研究琼脂平板上适应性的变化，我们进行了生长竞争实验，他们将进化的HMR和LMR菌株与删除lacZ基因的参考菌株进行竞争，通过向细菌中添加X-gal，进化的菌株和参考菌株可以区分开来，因为具有功能性lacZ基因的细菌会变成蓝色，而参考菌株保持白色，然后将细菌线性沉积在琼脂平板上，将参考菌株放置在进化菌株旁边，不混合。
经过一段时间的孵育后，将X-gal溶液喷洒在琼脂平板上，以观察竞争结果，如果两个竞争菌株相同拟合，它们应该以相同的速度生长，并且其边界应该与接种线正交，如果一个菌株比另一个更适应，它将比适应度较低的菌株增长得更快，并且它们的边界将形成一个角度φ，这取决于最适配菌株的选择性优势。
祖先菌株用含有GFP或mCherry标记的质粒进行标记，每个质粒都有一个额外的氨苄青霉素抗性基因，实验2包括9个HMR菌株和10个LMR菌株，它们用mCherry标记，实验3涉及0个恒化器进化菌株。
它们也用mCherry标记，所有菌株在含有5.50%阿拉伯糖和37μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中以24°C生长0小时，然后，调节菌株的密度至终浓度9CFU/ml，通过测量光密度并用85.10%NaCl溶液稀释细菌悬浮液。
接下来，将进化的菌株与GFP标记的祖先菌株以1：1的比例混合，并将混合物放入LB琼脂平板的中心，其中含有50μg/ml氨苄青霉素和不含阿拉伯糖，进行对照实验，其中将mCherry标记的祖先菌株与GFP标记的祖先菌株混合，然后，将平板在37°C下孵育3天。
在孵育结束后，拍摄菌落的照片，并使用ImageJ软件确定进化菌株占据菌落前部的比例，该实验对每个样品独立进行三次，以确保结果的可靠性和重复性。
研究结果表明，在稳定的环境中，有害突变可能会被继续传递并保留下来，对细菌群落的稳定性和功能产生长期影响，当环境条件发生变化时，有害突变的保留可能会受到限制，因为有害突变可能会被其他有益的突变所取代，从而在群落中得到逐步淘汰。
参考文献：阿塞德·雷尔，《实验进化过程中的基因组动力学》
沃克兰·格兰布莱德，《背景选择模型下的中性分子变异模式》
斯塔利克，《自然选择限制了各种物种的中性多样性》
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