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前言细菌 Sphingobium sp. 的 SYK-6 菌株一个次级切割途径催化木质素衍生的双苯基。在这条途径中，LigY 被提议作为催化次级切割产物 4,11-二羧基-8-羟基-9-甲氧基-2-羟基-6-氧代-6-苯基-己-2,4-二烯酸的水解。
鉴定产物为5-羧基香草醇酸和4-羧基-2-羟基戊-2,4-二烯酸，确定了 kcat 和 kcat/Km 值分别为9.3 ± 0.6 s^-1 和 2.5 ± 0.2 × 10^7 m^-1 s^-1。序列分析和1.9 Å 分辨率的晶体结构表明，LigY 属于酰胺水解酶超家族，不同于先前表征的 α/β-酯酶超家族的 MCP 水解酶，后者是依赖丝氨酸的酶。
LigY 的活性位点结构类似于 α-氨基-β-羧基-μ-康尼酸-ε-半醛脱羧酶，一种 III 类酰胺水解酶，其活性位点含有由 His-6、His-8、His-179 和 Glu-282 配位的单个锌离子。
对其他酰胺水解酶中用于激活水的保守残基 His-223 进行替换，对 kcat 的影响要比其他酰胺水解酶报道的小得多，这表明 His-223 在 LigY 中具有不同的作用。对 Arg-72、Tyr-190、Arg-234 或 Glu-282 进行替换，使 LigY 的活性降低了 100 倍以上。
提出了一个催化机制，涉及底物互变异构，底物辅助激活水的水解，以及产生一个双醇中间体。这最后一步与丝氨酸依赖的 MCP 水解酶不同。
在能够生长在由木质素衍生的芳香化合物上的细菌菌株中，Sphingobium sp. SYK-6 菌株已被认定为最具特征的之一，已经确定了对β-芳基醚、松树脂醇、二芳基丙烷、苯基香豆素和2,2′-二羟基-3,3′-二甲氧基-5,5′-二羧基联苯3 的分解代谢途径 。
SYK-6 对 DDVA 的分解代谢已经在遗传学上得到了阐明，并且对其中的一些酶进行了表征。 ligX 编码的氧化酶对 DDVA 的去甲基化产生了2,2′,3-三羟基-3′-甲氧基-5,5′-二羧基联苯。
LigZ，一种外二醇双加氧酶，对 OH-DDVA 进行间位切割产生4,11-二羧基-8-羟基-9-甲氧基-2-羟基-6-氧代-6-苯基己-2,4-二烯酸。
DCHM-HOPDA 被 LigY 转化，这是一种被认为是次级切割产物水解酶，产生5-羧基香草酸和一个第二产物，被假定为4-羧基-2-羟基戊-2,4-二烯酸。5CVA 被 LigW 转化为香草酸，它是酰胺水解酶超家族的脱羧酶成员 。
MCP水解酶催化芳烃的二氧化氧介导的间位环裂解形成的缩并型1,5-二酮的水解反应。所描述的MCP水解酶属于α/β-水解酶超家族，并利用Ser-His-Asp三元组催化C-C键断裂。
正如Bugg及其合作者首次提出的，反应机制涉及两个半反应：首先是烯醇-酮互变异构生成一个离散的酮中间体，然后是立体特异性的C-C断裂反应。
在第一个半反应中，酶使底物的二烯酸基团产生应变，然后被认为是去质子化催化性丝氨酸，同时完成酮化并激活丝氨酸亲核试剂。
第二个半反应最初被认为是一个伪胄醇进行的，其中催化性丝氨酸作为一般碱去质子化水。随后观察到一个催化相关的酰酶中间体证明了这一点。
LigY与α/β-水解酶没有显著的氨基酸序列相同性。只有一个反应产物5CVA被鉴定出，当反应在H218O中进行时，该产物被同位素标记，与水解反应一致。
与α/β-水解酶进一步相似的是，一些酰胺水解酶家族能催化热力学上更具挑战性的C-C断裂反应。首个被描述的酶是α-氨基-β-羧基丁二酸-ε-半醛脱羧酶。基于活性位点存在的单个锌离子以及配位残基的身份，ACMSD属于III类酰胺水解酶。
许多典型的III类酰胺水解酶是水解脱氨酶，分别属于COG0402。ACMSD与其他脱羧酶、LigJ以及CouO一起属于COG2159。
LigY的氨基酸序列与已经鉴定的MCP水解酶有较低的相似性。对NCBI数据库的非冗余蛋白序列进行的BLASTp搜索确定了LigY作为酰胺水解酶超家族成员。
在COG2159酶中，LigY与LigJ具有最大的氨基酸序列相似性，与多个脱羧酶具有约20%的相似性：ACMSD、2,6-二羟基苯甲酸脱羧酶、尿嘧啶-5-羧基脱羧酶和LigW。将LigY与这些同源物进行比对表明，LigY在这些酶中具有与Zn2 结合的基序。
异源产生的LigY经过纯化，SDS-PAGE分析得出纯度大于99%，产量为细胞培养液中蛋白质含量的5-10毫克/升。
纯化蛋白质的质谱分析与预测的LigY分子质量相符，表明存在N末端的甲硫氨酸。感应耦合等离子质谱分析显示，纯化的LigY每个构象体含有0.93 ± 0.07个锌当量，镉、钴、铜、铁、锰和镍含量微不足道。
尺寸排阻色谱-多角度光散射分析表明，LigY在溶液中存在单分散的种类，质量为208 ± 2 kDa，与六聚体一致。蛋白质在280 nm处的吸收分析与使用BCA测定法测得的蛋白质浓度相一致。
在222 nm和212 nm处的远紫外圆二色谱最小值表明高含量的α-螺旋二级结构。当生长培养基未补充Zn^2 时，纯化的LigY含约0.5个锌当量。
为了识别LigY的反应产物，OH-DDVA与LigZ和LigY的混合物一起孵育。这种方法最小化了LigZ产生的MCP的非酶催化转化。反应产物的HPLC分析显示存在5CVA，与先前的报告一致，以及另一个主要峰，其量与5CVA成比例。
该化合物的质谱分析显示其亲和母离子具有157.01的m/z值，与预测的单负离子化的CHPD质量相一致。该化合物可以与二硝基苯肼发生衍生化反应，表明存在α-酮酸。
在反向相HPLC中，衍生化的化合物以吸收和极性与DNPH-CHPD一致的方式洗脱和2-羟基戊二烯酸衍生物之间。
用质谱法确定了DNPH-衍生的α-酮酸的身份。DNPH衍生化证实了CHPD是LigY催化的反应的第二个产物。连同先前对5CVA的鉴定，这些数据证实LigY催化了DCHM-HOPDA的水解。
为了评估LigY的稳态动力学参数，开发了一种基于5CVA荧光的测定方法。使用LigW进行了对5CVA荧光信号的依赖性研究，LigW能够脱羧化5CVA，使其生成荧光较弱的香草酸。在过量的LigW存在下，活性测定中没有检测到荧光。
在pH值超过7.5时，DCHM-HOPDA的荧光显著增强，尤其是在Good's缓冲液存在下。相比之下，5CVA的荧光量子产率在pH 6到9之间没有明显变化。
考虑到LigZ活性的pH依赖性以及为了最小化在高pH下观察到的背景荧光，随后的动力学测定在pH 7.5下使用磷酸钾进行。
LigY对DCHM-HOPDA的稳态水解表现出Michaelis-Menten行为。在pH 7.5下，LigY的催化转化数为9.3 ± 0.6 s^-1，基于制备物中金属离子含量计算得到的kcat/Km值为2.5 ± 0.2 × 10^7 m^-1 s^-1。LigY并未明显水解来自联苯降解的2-羟基-6-氧代-6-苯基己-2,4-二烯酸。
为了评估金属辅因子的重要性，螯合法从LigY中去除了金属离子。在pH 6.0下，将酶在邻菲啉和EDTA存在下进行48小时透析生成了裸露的LigY。在pH 7-8下，金属离子未被明显去除，而在pH 5.5以下，LigY会不可逆地变性。
裸露的LigY的特异活性不足WT LigY的5%。将裸露的LigY与ZnCl2一起孵育部分恢复了酶活性。未能将裸露的LigY恢复到与纯化酶相同的特异活性。具有约0.5锌占有率的纯化LigY的特异活性约为具有完全锌占有率的纯化LigY的50%。
LigY的晶体结构在1.9Å的分辨率下解析出来。非对称单元含有三个完整的蛋白质单体。每个模型包含编码基因产物的所有332个氨基酸残基，以及来自TEV蛋白酶识别序列的C端附加残基。
这些单体具有高度相似的结构，平均Cα的RMSD为∼0.33Å，COOT的最小二乘超重叠工具确定。A和B单体非晶态2倍对称性相关，并具有2200Å^2的界面。A单体还与C单体结合，界面较小，为900Å^2。
共享较大界面的单体被认为是功能二聚体，Arg-234是此界面的一部分，对其相应的二聚体伙伴的活性位点有贡献。
功能二聚体的界面被定义为二聚体内界面。在晶体中观察到的六聚体可以非晶态单元的2倍旋转对称性重构，并基于六聚体的非晶态3倍对称性被表征为二聚��三聚体�体。
与LigY结构高度相关的密切相关序列的系统发育分析揭示了二聚体内界面上高度保守的区域。相反，其他界面上的残基保守性较差。表面电荷分析进一步表明，二聚体内的相互作用由几个极性相互作用区域组成，而其他界面则主要由疏水相互作用主导。
LigY的活性位点位于β-折叠核心的中心，与其他III类酰胺水解酶如ACMSD中观察到的情况相同。异常地图证实LigY是单核的，每个单体的活性位点中观察到单一的异常峰。
金属荧光扫描和异常地图密度峰值计算也与Zn2 是活性位点离子一致。这个金属离子由His-6、His-8和His-179配位，由Glu-282部分配位。这四个残基对应于其他酰胺水解酶超家族成员中的金属结合配体，酸性配体通��天冬�冬酰胺。
电子密度显示LigY三个单体的活性位点中存在构象异质性。这些被Glu-282突出，Glu-282在两个构象中被观察到。在一个构象中，侧链朝向Zn2 并配位于金属。在第二个构象中，羧基远离金属离子。
在C单体中，Glu-282处于单一构象中，远离金属离子。在A和B单体中，Glu-282似乎都采用了两种构象，金属配位构象的占有率分别为约60%和30%，��Phenix.nix.refine的精修估计。
第二个差异与Glu-282的构象有关，涉及一个位于C单体中与Zn2 相邻的大球形电子密度。这个密度对于水分子来说太大，被建模为Cl-离子，它存在于母液中。在异常地图中未观察到峰值，表明它不是过渡金属离子。
Zn2 –Cl-的原子间距为1.9Å，而无�配合物��物的报道值为2.2Å。在A和B单体中存在对应于Cl-的电子密度，由于空间冲突，这些链的模型中没有包括阴离子离子。
在LigY中建模了两种活性位点金属配位几何构型。在五配位几何构型中，主要在A单体中，Zn2 由组氨酸氨酸、Glu-282和一个溶剂物质配位。
在四配位几何构型中，模拟在C单体中，Zn2 由三个组氨酸和一个Cl-离子配位。B单体中观察到的状态似乎是两种几何构型的混合体。
除了金属配体外，LigY活性位点还含有几个其他显著的残基。His-223在III类酰胺水解酶中是保守的，并且与这些酶一样，水分子作为第二壳层金属配体。
在任何LigY单体中，His-223都不在与金属结合的溶剂物质的氢键距离内，当后者配位到Zn2 时，它可能与Glu-282形成氢键。
活性位点还包含来自其二聚体伙伴的Arg-234，这种排列在已知结构的COG2159酶中得以保留。在ACSMD中，已提出这个精氨酸结合到α-氨基-β-羧基木酮-ε-半醛的C1羧酸根。在LigW中，这个精氨酸与底物类似物5-硝基香草酸的硝基团相互作用。
LigY的活性位点还包含Ser-222。这个残基在酰胺水解酶中不保守，它与His-223和Glu-198的距离很近。LigY不包含COG0402类III酰胺水解酶中保守的谷氨酸。这个残基由CDA中的Glu-217代表，并且被认为在COG0402酶中作为酸碱催化剂脱去金属结合水中的质子。
结语氯离子对LigY活性的抑制，一个单体中观察到Zn2 -结合的Cl-离子提出了两个假设，Glu-282易于被替代，Cl-离子抑制LigY的活性。在增加离子强度的条件下测量了LigY的活性，其中离子强度是使用KCl或磷酸钾来增加的。
在这些实验中，LigY的比活性随着Cl-浓度的增加呈指数衰减，而磷酸盐则没有，表明这种效应是特异的。
高浓度的KCl对于实验中使用的LigZ的活性影响微不足道。无论使用NaCl还是KCl，都观察到了类似的抑制作用，表明氯离子是抑制物种。
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