在【脑科学研究攻略】专栏，brainnews特邀的作者将给大家分享他们总结的一些研究思路，供大家学习和借鉴，欢迎留言一起交流。今天是第一篇，关于脑区的精细划分。
我们对大脑的研究是从大脑各个区域的精确区分开始。目前科学家已经对不同脑区的功能有了一定的了解，但还不够详实和细致。研究人员们早期主要利用解剖学特征对大脑区域进行区分。如今，随着科研技术的进展，他们还可以利用遗传学特性、脑区之间神经投射连接特性、行为学功能特异性将脑区做进一步的细致划分。
面对大脑这个最复杂多样的器官，全世界的神经脑科学科研工作者们都在在做着愚公移山一样的工作：通过每个团队的努力，试图一点一点的将整个大脑的功能进行完全解析。在众多的研究中一个非常朴素又十分重要的研究思路就是将原已确定划分与功能的某一脑区进行精确再细分。
接下来我们通过几个研究实例简要介绍一下不同研究团队都利用什么样的方法与策略来将脑区进行进一步的细分。
图源：fuzzylogix.com
腹内侧下丘脑的腹外侧：攻击性行为的核心脑区再挖掘在2017年Nature NeuroScience上发表的一文中，来自纽约大学的Dayu Lin研究团队发现腹内侧下丘脑的腹外侧（VMHvl）的Esr1 神经元可以调控雌性小鼠的攻击性行为。
VMHvl在解剖学上结构本就已经很小，但是该研究团队依然本着精益求精的科学态度，通过Nissl染色解剖形态学分析发现该区域中间存在一个天然的“沟壑”（一个长条状缺少神经元胞体区域）将该区域进一步划分成内侧和外侧（VMHpvlm 和VMHpvll）。
通过免疫荧光染色也发现，Esr1 细胞主要分布在VMHpvll。通过行为学诱导c-fos表达也发现，攻击性行为诱导c-fos主要表达在VMHpvlm，而交配行为诱导c-fos主要表达在VMHpvll。
随后，为了进一步探究两个区域转录组上的区别，该研究小组利用激光捕获显微切割对两个区域进行了“极限操作”，将两块区域分别切割下来进行了转录组测序，并且证实了不同基因转录水平上的差异。
这些数据都证实了VMHpvlm 和VMHpvll存在解剖上、分子上以及功能上的区别。在后续的下游神经投射的分析中也发现，仅VMHpvll区域的神经元可以投射到前房室周围核（anteroventral periventricular nucleus, AVPV）且该环路与交配行为密切相关，而与攻击性行为无关。
然而该课题组并没有停下对VMHvl脑区功能精细划分的脚步。在2019年该课题组在Cell Report再次发文探究VMHvl不同区域在防御行为（相对于之前的攻击性行为研究）中的功能。
在上一个研究中，研究人员探讨的是同一冠状切面下该区域的内侧与外侧的区别。这一次，研究人员关注的是在不同的冠状切面下该区域的区别，VMHvl被分为前侧和后侧（前侧更靠近嗅球，离Bregma点更近，分别为aVMHvl和pVMHvl）。
这次他们利用的依旧是不同行为下c-fos的表达量的区别，对VMHvl范围内前后侧所有脑片进行染色技术分析发现，在小鼠进行防御时aVMHvl区的c-fos表达量有明显的升高，且被标记的神经元大部分为Ers1阳性的。接下来研究人员利用双通道光纤记录系统在同一只小鼠中记录aVMHvl和pVMHvl区域Ers1 神经元的活动性在社交行为中的变化。
结果发现，在小鼠进行防御行为时，aVMHvl中Ers1 神经元活动性相比于pVMHvl有更显著的升高。随后，在环路的研究中也发现，aVMHvl和pVMHvl有着不同的投射模式。aVMHvl投射到更加靠后的脑区（如中脑导水管周围灰质, PAG），而pVMHvl在投射模式中并没有偏向性。
该课题组再次在各个层面证实了VMHvl脑区无论是在分子上还是功能上都需要被进一步的精确细分。笔者也十分佩服该课题组工作的严谨与细致。
但是两篇文章都没有利用光遗传学对细分的两个区域分别标记再进行操控并观察其对行为的影响。笔者猜测主要是由于细分后的两个脑区并没有产生功能上的对立情况，且区别两个脑区的功能差异也不是两篇文章想要论述的核心。而接下来要讨论的这个研究，则真正找到了一个脑区中存在两个功能各异的子区域。
丘脑室旁核前侧后侧在遗传、解剖、和功能上的精确区分该研究来自斯坦福大学Mario A. Penzo 课题组在2020年1月于Nature Neuroscience上发表的成果，发现PVT前侧后侧分布着从解剖、遗传特性、功能层面都不同的两类神经元。
由于在中央丘脑分布着丰富的多巴胺D2受体（有Drd2基因表达的D2Rs），所以研究人员利用RNA原位杂交技术检测PVT前侧后侧（aPVT, pPVT）的Drd2的分布情况。发现pPVT中分布丰富，而aPVT几乎没有Drd2。接下来作者利用艾伦脑机构开源的小鼠脑连接组数据库中检索到若干基因改造的Cre转基因鼠用于PVT的神经元标记。
通过进一步比对发现，Gal基因选择性的表达在aPVT中,而几乎不表达在pPVT中。这就说明Gal-Cre转基因鼠有可能作为很好的工具来研究aPVT在行为学中的功能。但是通过后续研究发现实际实验中外源以Cre依赖的AAV并不能很好的表达。该研究小组随后利用Cre-Off系统在Drd2-Cre中标记非Drd2阳性的细胞来操控aPVT的神经元。（实验研究并不是一帆风顺的，往往研究十之八九都是阴性结果，但是我们要有发现问题的严谨的态度，面对问题的勇气和信心，解决问题时灵活的思维）
在确定可以利用遗传学手段分别标记aPVT和pPVT两类神经元之后，研究人员利用光纤记录系统发现，两类神经元对积极/消极刺激反应不同:
- pPVT神经元活动性可以被消极刺激所激活，而被积极刺激所抑制；
- 与pPVT不同的是，无论是积极刺激还是消极刺激，aPVT II类神经元活动性都成下降状态。
更进一步的，投射到PVT区域的前额皮层（mPFC）的aPVT中II类神经元对积极/消极刺激的反应是一致的，而反向激活mPFC-aPVT该通路可以抵消aPVT神经元的响应。
以前的研究证实PVT对不同效价的刺激（积极刺激与消极刺激）具有双向调节的功能，这在pPVT中也得到了验证。但是aPVT神经元活动性的变化说明aPVT的反应并不依赖刺激的效价。为此研究人员猜测aPVT可能与小鼠状态的变化相关。状态变化最为明显的实例则是清醒与睡眠状态的转换。
为了探究aPVT II类神经元活动性与小鼠状态（清醒或非快速动眼睡眠）的关系，研究人员利用EEG记录耦合光纤记录系统记录小鼠的活动状态，研究人员发现：当小鼠从非快速动眼睡眠到清醒状态这一过程中，aPVT II类神经元活动性逐渐降低；反之，当小鼠从清醒状态进入到非快速动眼睡眠状态。该类神经元活动性逐渐升高。化学遗传激活此类神经元可以促进小鼠更多的进入非快速动眼睡眠阶段。由此延伸，通过对小鼠瞳孔大小来监测小鼠状态的变化发现，激活或者抑制mPFC-aPVT该通路可以双向调控由尾部电击导致的小鼠状态的变化。
以上三篇文章我们可以看到两个研究小组利用了免疫染色，行为学耦合c-fos标记，RNA测序技术，光纤记录技术、光遗传学技术，对某一个脑区进行了精确的再细分。我们可以注意到，这些脑区本身尺寸本身非常小，需要精湛的实验操作技术，与夯实的实验数据结果，才能将脑区进行精细的划分，撰写的文章才能受到同行评议的认可。
笔者原本打算引用在2019年5月于Science发表的一篇文章（DOI: 10.1126/science.aaw0474）再举一个脑区精细化分的实例，但是令人感到惊讶的是，当笔者再次打开Science官网准备寻找该文献的附录时，发现这篇文章已经在2019年的12月被撤回了……我们可以在官网中看到撤回原因：文章的第一作者涉嫌行为学数据造假。此举不禁令人感到错愕。也希望每一位科研工作者都能对自己的数据负责。
参考文献：
1.Hashikawa, K. et al. Esr1 cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nat. Neurosci. 20, 1580–1590 (2017).
2.Wang, L. et al. Hypothalamic Control of Conspecific Self-Defense. Cell Rep. 26, 1747–1758.e5 (2019).
3.Gao, C. et al. Two genetically, anatomically and functionally distinct cell types segregate across anteroposterior axis of paraventricular thalamus. Nat. Neurosci. (2020).
作者信息编译作者：Soda（brainnews创作团队）
校审：Cong and Simon（brainnews编辑部）
