肝细胞癌组织及外周血T细胞受体测序揭示肿瘤不同分期特征（克隆战争 Clone Evolution）

T 淋巴细胞通过细胞表面特定T细胞受体（TCR）识别抗原主要组织相容性复合物（MHC）分子，在人类适应性免疫中发挥重要作用。95%的T细胞的TCR是由α和β两条肽链通过链间二硫键连结组成α/β异二聚体，每条链由恒定和可变结构域组成。TCR多样性是由于肽链可变区（V）、多变区（D）和连接区（J）基因片段重排以及核苷酸的随机添加或缺失形成的。肝细胞癌（HCC）在全球癌症相关死亡原因中排名第四。HCC免疫微环境包含具有不同功能的T淋巴细胞亚群，目前，HCC各个分期中的TCR多样性及克隆性特征尚不清楚。

在第57届欧洲肝病研究学会年会（EASL2022）暨2022年国际肝脏大会™（ILC 2022）上，南方科技大学医学院王艺瑾教授团队报告了一项最新研究成果，旨在探究不同分期HCC的不同组织来源的T细胞TCR特征，该研究将有助于阐明HCC进展机制并开发针对特定新抗原的细胞治疗方法（摘要编号：SAT558）。《国际肝病》特邀请王艺瑾教授为我们介绍该研究的成果及临床意义。

研究方法

根据HCC BCLC分期标准，前瞻性纳入经影像学和病理学诊断证实的早期（BCLC-A）、中期（BCLC-B）、晚期（BCLC-C）HCC患者各10例，收集患者的肝肿瘤组织、癌旁组织以及外周血单核细胞（PBMC）。对肿瘤标本进行多重免疫组化实验（mIHC），检测不同BCLC分期的T细胞抑制性受体的表达水平。利用ImmuHub技术平台对所有样本进行TCR-β测序（图1）。对比IMGT数据库，分别对每个样本的V、D、J、C片段数据结果进行匹配，获得每条序列中V、D、J和C基因片段ID，鉴定出克隆的CDR3核酸序列以及氨基酸序列，并对得到的每种克隆进行计数和频率计算。

图1.实验设计流程

研究结果

不同BCLC分期HCC抑制性T细胞表达分布

对TCR-β测序成功的肝肿瘤组织样本进行mIHC实验，检测免疫检查点分子PD-1、LAG-3和CTLA-4的表达水平（图2），探索在不同BCLC分期HCC患者肿瘤免疫微环境中抑制性T细胞情况。结果表明，BCLC-B期（32.49%）和BCLC-C期（28.91%）HCC患者的T细胞比例高于BCLC-A期（21.46%）患者。BCLC-C期的PD1 细胞比例高于BCLC-A和BCLC-B期，而LAG-3 和CTLA-4 细胞比例在BCLC-B期最高。进一步分析PD1 、LAG-3 和CTLA-4 细胞占CD3 T细胞的比例显示，BCLC-C期的PD-1 /CD3 比例显著高于BCLC-A（P=0.025）和BCLC-B期（P=0.002）；而LAG-3 /CD3 比例在BCLC-B期表达水平高于BCLC-A（P=0.029）和BCLC-C期。

图2.来自24名患者肿瘤组织的mIHC分析

CDR3序列的多样性和克隆性分析

TCR中的CDR3序列是决定TCR多样性的主要区域，出现频率最高的100个CDR3所占总CDR3的比例（TOP100 CDR3）通常用于评价TCR多样性。不同BCLC分期的肝肿瘤组织、癌旁组织及PBMC样本中TOP100 CDR3分布情况如图3A-C。肿瘤组织中，TOP100 CDR3在早、中、晚期患者中频率分别为52.81%，35.11%，41.04%。PBMC样本中，TOP100 CDR3比例在早中晚期频率分别为32.53%，25.87%，46.53%，提示晚期HCC患者PBMC中TCR多样性最低。

为详细了解CDR3频率分布情况，我们计算每个样本中CDR3累积频率，并将克隆分布从最高频率到最低频率分为14个组（图3D-L）。肿瘤组织中，TOP 50 CDR3在BCLC-A、BCLC-B、BCLC-C期患者中频率分别为46.67%，27.87%，34.27%。PBMC样本中，TOP50 CDR3在BCLC-A、BCLC-B、BCLC-C期患者中频率分别29.23%，23.10%，43.59%。进一步提示PBMC中TCR在晚期HCC患者克隆性显著增加，多样性显著减少。

考虑到Clone Fraction的差异，我们按照CDR3序列累积频率的不同分为High组（Clone Fraction>=0.1%），Mid组（0.01%<Clone Fraction<0.1%），Low组（Clone Fraction<=0.01%）。CDR3分布频率在早、中、晚期的肿瘤组织中没有显著差异（图3M）。PBMC中，相比早期和中期，晚期HCC患者低频CDR3出现频率最低且高频CDR3出现频率最高，提示晚期HCC外周血T细胞TCR多样性降低、克隆性增加（图3N）。这可能与晚期肿瘤特异性抗原显著诱导T细胞形成相应新的T细胞亚群有关。

图3. BCLC-A、BCLC-B、BCLC-C期HCC患者肿瘤、癌旁和PBMC中TCRCDR3序列量化分析

复发患者TCR的多样性和克隆性分析

经随访，BCLC-A期患者中有6例出现肿瘤复发，3例未复发。为了解复发和非复发组肿瘤和PBMC中TCR多样性和克隆性的差异，我们进一步分析了两组患者的TCR特征，包括V(D)J基因片段使用频率、CDR3序列分布和氨基酸组成。我们观察到复发和非复发组样本的V(D)J基因片段使用趋势相似，例如TRBV 5-1/20-1和TRBJ2-1/2-7在复发和非复发组均是最高使用频率的V(D)J片段（图4B-D）。

在复发组中，PBMC和肿瘤样本TOP100 CDR3频率分别为28.37%和36.40%；TOP50 CDR3频率分别为24.67%和27.1%。在非复发组中，PBMC和肿瘤样本TOP100 CDR3频率分别为41.94%和75.98%；TOP50 CDR3频率分别为39.38%和73.82%。复发与非复发患者的PBMC中TOP100 CDR3没有显著差异，而复发组患者肿瘤组织的TOP100 CDR3频率低于非复发组肿瘤组织，以上结果表明复发组HCC患者TCR多样性增多、克隆性减少，提示TCR多样性高与术后复发具有相关性（图4E-G）。

TCR克隆性和多样性指数分析进一步证实TCR克隆性低与肿瘤复发相关（图4J）。该结果提示早期肿瘤患者若出现T细胞响应肿瘤抗原进行TCR克隆性增殖可能预示术后复发率低，而未出现克隆性增殖则代表T细胞并未对肿瘤抗原作出响应，因此预后不良。我们还发现复发组中疏水氨基酸使用频率低于非复发组，这与之前报道的疏水性氨基酸可以促进自身反应性T细胞的激活相一致（图4K-L）。

图4. 复发和非复发患者的TCR特征分析

研究结论

该研究阐明了不同BCLC分期的HCC肿瘤组织、癌旁组织及外周血单核细胞中TCR特征，同时进行了时间上不同分期的纵向比对和空间上不同样本的横向比对，从而揭示了HCC不同时期TCR特征。HCC患者中，BCLC-B-C期免疫检查点PD-1、LAG-3和CTLA-4存在较高表达水平。BCLC-C期外周血T细胞的TCR克隆性显著增加，多样性显著减少，提示PBMC比肿瘤组织能更好地描绘HCC患者不同肿瘤分期的TCR特征。

鉴于复发组中TCR多样性增多、克隆性减少，肿瘤组织的TCR特征可以更好预测早期患者术后复发情况。在肿瘤复发的情况下，我们推测PBMC和肿瘤中存在较高比例的记忆T细胞库识别具有相同序列或结构相似性的抗原，并激活免疫系统中的T细胞克隆。

研究者说

阐明不同时期HCC的TCR特征对于了解肿瘤免疫逃逸机制和开发更有效的免疫疗法至关重要。我们在描绘不同BCLC期HCC患者的TCR特征后，还需进一步探索TCR特征与HCC进展的因果关系。另一方面，随着靶向治疗的发展和精准治疗的需求，如何通过患者肿瘤特异性TCR检测从而进行T细胞修饰，将成为未来发展趋势。

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