转座子随机插入突变体库——获得新靶点的绝佳方法

随着全基因组测序技术的发展，越来越多的细菌的全基因组数据得到揭示，细菌基因组较小，但是在人们生活中频繁出现，不论是益生菌还是有害菌，都和人民息息相关。那么细菌是如何致病的呢？每个基因的功能是什么呢，目前知之甚少。认识细菌基因功能的一个最重要的方法就是构建该基因的突变株，然后根据突变株表型变化来确定该基因的功能。大家常用的突变体株构建方法一般是CRISPR、或者同源*，甚至也有人使用RNAi沉默方式构建突变体。下面给大家介绍一下另外一种方法——突变体文库。

细菌的突变体文库，就是针对某细菌的每一个非关键基因构建一个相应的突变株，然后将所有的突变株汇集在一起，即构成该细菌的突变株文库。

建立细菌的突变株文库最成熟的技术就是利用转座子随机插入的特点，构建细菌的转座子随机插入突变体库。当转座子插入基因内部直接打断基因阅读框时，我们就获得了该基因的突变体。多类转座子都被用于构建细菌的单基因突变体文库，如Tn3、Tn5、Tn10 及 mariner家族转座元件等。其中Himar1转座元件是在细菌诱变中应用最广泛的mariner 家族转座元件，它催化TA双核苷酸位点的单拷贝插入，随机性强，覆盖率高，也是目前我们构建细菌转座子随机插入突变体库的主要手段。此类方式就类似于拟南芥突变体库方式，当你针对某个菌株研究多种方向，需要获得多种基因的突变体菌株时，那么突变体文库是最好的方式，省时省力，并且还可以通过文库筛选获得一些未知基因的功能，对于筛选新基因是一个很好的方式。细菌由于基因组小，因此构建突变体库也不会如动物植物难，通过随机插入的方式，就可以筛选得到整个基因组每个基因的突变株。

转座子破坏编码基因示意图

转座子插入突变体库构建及鉴定示意图

目前我们已在多类细菌中建立了转座子随机插入突变体文库，清单如下：

转座子突变体文库获得后，该如何应用呢？总体可以考虑表型筛选（耐药性、致病性、感染性等等），以及深入的机制研究；甚至也可以通过菌株改造深入获得某一株工业发展可以使用的菌株。下面给大家简单介绍一下

2021 IF=7.4 A systematic analysis of hypermucoviscosity and capsule reveals distinct and overlapping genes that impact Klebsiella pneumoniae fitness

高黏滞性（Hypermucoviscosity，hmv）是高致病性肺炎克雷伯菌是一项重要特征。尽管hmv需要荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）的合成，但这可能不是唯一影响因素。为了明确hmv与CPS之间的联系和区别，该文章以转座子突变体文库为出发点展开了一系列的相关研究。

首先作者以高黏滞性肺炎克雷伯杆菌株KPPR1为出发菌株，利用himar1转座元件构建了总数为18598株的突变体文库，并通过对转座子的定位测序，最终获得了可明确转座子插入位点的突变株14895株，从每个ORF的打断插入中选择1株有代表性的突变株形成浓缩突变体库，共3733株，覆盖了全基因组ORF总数量的71.6%。

为了确定各突变株的黏滞特性，作者对3733株突变株进行了拉丝实验和离心沉降实验。在拉丝实验中，hmv菌株的拉丝长度会超过5mm，同时其液体培养物离心后，高黏滞性菌体会被留在上清中，而无黏滞性菌体会被离心至管底聚团。通过这两项测试，作者筛选到了44株低黏滞性突变株，它们被破坏的基因位点分别如下：

随后通过糖醛酸（uronic acid）含量测定分析了这44个突变株的荚膜多糖（CPS）产量，其中97%的hmv0突变株和63.6%的hmvlow突变株的CPS产量明显低于出发菌株，另外一些hmvlow突变株的CPS产量虽然与hmv0突变株接近，但是却保留了一部分黏滞特性，这些结果说明荚膜多糖的产量会影响菌株的黏滞特性，但并不是唯一必需因素，还存在其他胞内因素影响hmv特性。

这44个突变株所涉及的44个基因，包括了已被报道的6个影响hmv和CPS产量的基因(wzi, wza, rmpA, kvrB, pgi和ompR)，这为通过转座子随机插入突变体文库筛选获得的结果可靠性提供了依据。这些基因涉及糖转运、氨基酸转运、渗透保护剂转运、TCA循环、C4二羧酸代谢、糖代谢、DNA复制等多个方面，拓宽了人们对hmv分子机制的理解。

随后利用density-TraDISort试验检测了3733株突变株的浮力改变，鉴定到浮力增加的突变株20株，浮力减小的突变株36株。作者推测这36个突变株的CPS含量均会明显降低，而实际情况是只有其中14株的hmv或CPS产量发生了明显降低。

浮力减小突变株的荚膜多糖产量和黏滞性测试

作者将这些筛选结果汇总后，根据表型将筛选出的突变株分为6类：hmvlow/CPSlow ，hmvWT/CPSlow ，hmvlow/CPSWT ，hmvhigh/CPSWT， hmvWT/CPShigh， hmvlow/CPShigh，hmvhigh/CPShigh。为了验证转座子突变体文库筛选技术的有效性，作者从6类突变株中共选取了具有代表性的27株突变株，分别对其被打断的基因进行了缺失突变株的构建。构建的缺失突变株随后也进行了荚膜多糖产量和黏滞性测试，其中17株缺失突变株的表型与其相应的转座子插入突变体表型一致。说明突变体库筛选结果可靠性很高。

之后作者从6类突变株中各选择了1株缺失突变株进行了细胞黏附实验和血清暴露实验。通过该实验结果，作者获得了一个新的推论，hmv阻断细菌与宿主细胞的联系，而CPS保护血清中的细菌。

通过该篇文章的分析，我们可以看出转座子插入突变体文库的一些优势：

1. 在突变体库构建中致死基因无法获得突变株，该文章构建的突变体文库覆盖了全基因组ORF总数的71.6%，共计3733个基因的突变株，为从全基因组水平研究基因功能或表型机制提供了基础。
2. 突变体文库筛选结果可靠，且易挖掘到新的靶点基因。该文章中筛选到的产生hmv0和hmvlow 表型的44个基因，覆盖了已被报道的6个影响hmv表型的基因，说明突筛选结果的可靠性，同时又一次性获得大量影响hmv表型的基因，可以全面解析hmv的分子机制。
3. 在研究不同表型关系上具有明显优势。Hmv和CPS在临床分离株中往往相伴产生，较难区分其差异，而通过突变体文库的筛选，成功获得了6类表型的突变株：hmvlow/CPShigh，hmvlow/CPSWT ，hmvlow/CPSlow ， hmvWT/CPSlow ，hmvWT/CPShigh，，hmvhigh/CPSWT， hmvhigh/CPShigh，并通过这6类突变株的进一步测试获得了新的结论hmv阻断细菌与宿主细胞的联系，而CPS保护血清中的菌体，明确区分了hmv与CPS两个表型的差异。