作为近年来国自然课题申请和SCI文章发表中居高不下的热点，“铁死亡”研究还能进行怎样的创新性挖掘？
今天给大家分享一篇于2023年7月13日发表在Nature Communications（IF=16.6/Q1）的高分文章，题目为ACTL6A protects gastric cancer cells against ferroptosis through induction of glutathione synthesis。
该研究由中山大学王方乐堃、李孟鸿、康亮及团队主导，利用GEO数据库挖掘、RNA微阵列分析、稳定同位素示踪和CHIP等技术发现肌动蛋白样蛋白6A（ACTL6A）通过与核因子E2相关因子2（NRF2）协同上调谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基（GCLC）的表达，诱导半胱氨酸（GSH）的合成，由此抑制胃癌细胞铁死亡，促进胃癌的发生发展，有望成为胃癌的潜在治疗靶点。
doi:10.1038/s41467-023-39901-8
研究背景
胃癌（Gastric Cancer，GC）是一种恶性肿瘤，其发病率在全球范围内呈上升趋势。早期胃癌往往无明显症状，因此很难被发现，导致诊断时已经进入晚期。胃癌的治疗包括手术切除、化疗、放疗等，但晚期胃癌治疗效果较差。因此，早期预防和筛查对于降低胃癌发病率和提高治疗成功率十分重要。
铁死亡是一种铁依赖性的新型细胞程序性死亡方式。目前认为，铁死亡可逆转由癌基因驱动的细胞增殖和去分化，抑制肿瘤生长并增加多种肿瘤对化疗药物和免疫治疗的敏感性，因此癌细胞铁死亡的诱导为肿瘤治疗思路拓展提供了重要方向。然而，细胞类型特异性铁死亡敏感性的机制仍不清楚，未经治疗的癌症对铁死亡的固有易感性也因器官系统而异，需要进一步深入探究。
本期分享的这篇文章正是基于GEO数据库挖掘发现在胃癌中高表达的ACTL6A，利用体外类器官、体内小鼠实验探究ACTL6A影响胃癌细胞铁死亡的作用和机制。
主要内容
- GEO数据库分析GC数据集中胃癌组织表达显著上调的基因，对胃癌中高表达的ACTL6A进行临床组织样本验证，并利用细胞、类器官以及裸鼠异种移植分析ACTL6A对表型的影响；
- 基因集富集分析（GSEA）确定ACTL6A的表达与信号通路之间的关联，并在体内外验证ACTL6A对GSH代谢、ROS生成的影响；
- 多种细胞程序性死亡抑制剂以及其他抑制细胞生长的化合物分别处理GC细胞，确定ACTL6A影响的细胞铁死亡；
- 液相色谱质谱联用 (LC-MS）、同位素示踪技术检测GSH代谢途径代谢物命运，并在体内外进行验证ACTL6A对γ-GC合成的影响；
- GCL是与GSH代谢、γ-GC合成相关的限速酶，体内外实验检测ACTL6A对GCL亚基（GCLC、GCLM）表达水平的影响；
- 染色质免疫沉淀高通量测序 (ChIP-seq) 分析转录因子ACTL6A的作用位点，通过ChIP、qRT-PCR、co-IP技术进行验证；
- 异种移植NCG小鼠使用GCLC抑制剂处理，分析ACTL6A代谢轴与肿瘤进展、GC细胞铁死亡的临床相关性。
⏩本研究涉及的相互作用或调控因子为ACTL6A、GCL调控亚基GCLC和NRF2，涉及代谢轴ACTL6A-GCLC-GSH。在该机制中：
（1）ACTL6A主要通过上调γ-GC的合成来影响GSH从头合成；
（2）ACTL6A在转录水平上调γ-GC催化酶GCL催化亚基GCLC的表达；
（3）ACTL6A作为NRF2的共转录因子上调GCLC的转录；
（4）高表达ACTL6A通过影响GCLC-GSH代谢抑制了GC细胞铁死亡，ACTL6A疏水区HR结构域发挥了重要作用。
图1 ACTL6A介导的GSH合成并抑制铁死亡
研究结果
1. ACTL6A在GC中过表达并促进GC进展
研究团队首先对从GEO数据库中的GC数据集GSE13911、GSE27342、GSE13861获得mRNA表达数据进行分析。结果表明，癌组织中的ACTL6A表达水平高于癌旁正常组织。进一步地，团队分别在人源GC细胞系SNU638、患者来源类器官以及异种移植裸鼠中敲低和过表达ACTL6A，探究了该基因在GC肿瘤进展中所发挥的作用。结果发现，ACTL6A可促进GC细胞增殖生长，有助于GC发生发展。
图2 ACTL6A在GC中过表达并促进GC进展
2. ACTL6A重新编程GSH代谢以维持GC恶性进展
为了确定ACTL6A在GC中发挥的作用，研究团队对ACTL6A-KD SNU638细胞进行了RNA微阵列检测，并通过基因集富集分析（GSEA）以确定结果中ACTL6A表达与信号通路之间的关联。分析表明，GSH代谢相关通路是GC细胞中与ACTL6A表达差异相关性最高的途径之一。GSH作为一种抗氧化剂，可通过GSH/GSSG循环保护癌细胞免受氧化应激，降低细胞内ROS水平，从而促进肿瘤生长。进一步地，团队研究了ACTL6A对GSH合成的影响，发现ACTL6A敲低可导致部分参与GSH合成途径的基因（如GCLC、GPX2、GPX4、SLC7A11、SLC1A5、GSS、GLS等）表达下降，并且出现GSH/GSSG和NADP /NADPH比率降低的情况，且细胞内ROS水平较高。利用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可逆转ACTL6A敲低造成的影响。上述处理在GC异种移植小鼠中得到同样的结果。
图3 ACTL6A重新编程GSH代谢以维持GC恶性进展
3. ACTL6A抑制GC细胞铁死亡
由于铁死亡与ROS和GSH调节有关，研究团队对ACTL6A是否抑制GC细胞的铁死亡进行了探究。结果发现，在ACTL6A-KD细胞中，使用铁死亡抑制剂（Fer-1）处理，细胞活力显著恢复，而使用凋亡抑制剂或坏死性凋亡抑制剂处理未能逆转。同时，团队观察到ACTL6A-KD细胞对铁死亡诱导剂H2O2、erastin和BSO敏感，但对通过其他机制抑制细胞生长的化合物（例如依托泊苷和阿霉素）不敏感。进一步地，检测ACTL6A-KD细胞、类细胞以及异种移植裸鼠肿瘤组织的铁死亡标志物水平，证明了ACTL6A敲低可促进铁死亡并使细胞对氧化应激敏感。
图4 ACTL6A抑制铁死亡细胞死亡
4. ACTL6A 主要通过上调γ-谷氨酰-半胱氨酸合成来影响GSH从头合成
为了进一步评估ACTL6A调节GSH代谢的机制，研究团队通过液相色谱质谱联用（LC-MS）研究了U-13C葡萄糖的代谢命运。实验结果未观察到U-13C葡萄糖对谷氨酸、丝氨酸或甘氨酸总贡献的显著变化，但证实了ACTL6A-KD SNU638细胞中谷氨酰胺转化为谷氨酸，且异种移植裸鼠肿瘤组织的代谢物中ACTL6A敲低后出现γ-GC和GSH表达下调。因此，ACTL6A主要通过调节γ-GC的合成来影响GSH从头合成。
图5 ACTL6A主要通过上调γ-谷氨酰-半胱氨酸合成来影响GSH从头合成
5. ACTL6A通过NRF2在转录水平调节GCLC
GCL是GSH生物合成途径中的限速酶，γ-GC的合成由GCL催化。GCL为异二聚体，包含催化亚基（GCLC）和调节亚基（GCLM）两个亚基。研究团队发现，ACTL6A敲低时，GCLC的mRNA表达水平下调，ACTL6A过表达时则相反；而ACTL6A对GCLM的表达无影响。此外，ACTL6A敲低后，细胞中的GCLC蛋白的表达水平也随之下降。敲除ACTL6A可抑制异种移植裸鼠肿瘤组织中的GCLC表达。进一步地，团队在ACTL6A-KD细胞中过表达GCLC，发现GCLC逆转了ACTL6A敲低对细胞增殖的抑制，同时，还能恢复细胞ROS以及脂质过氧化水平。
图6 ACTL6A通过调节GCLC抑制GC细胞铁死亡
ACTL6A作为BAF染色质重塑复合体的成员，是一种转录因子。因此，研究团队对 GC细胞中的内源性ACTL6A进行染色质免疫沉淀高通量测序（ChIP-seq）在全基因组中寻找与ACTL6A结合的位点，以探索ACTL6A如何对GCLC进行调节。结果发现，ACTL6A可能作用于GCLC的转录起始位点（TSS），且TSS附近存在与NRF2结合基序高度同源的序列，推测ACTL6A可能与NRF2协同调节GCLC表达。对此，团队进行了NRF2敲低实验，发现ACTL6A-KD对GCLC表达的抑制作用减弱；而反过来，当ACTL6A被敲低时，NRF2-KD却对GCLC表达无影响。随后利用ChIP、qRT-PCR和co-IP证实NRF2和ACTL6A敲低均能削弱对方与GCLC启动子的相互作用。
总的来说，NRF2是GCLC的转录因子，ACTL6A与NRF2共同作用，影响NRF2与GCLC启动子的结合，从而在转录水平上调控GCLC的表达。
图7 ACTL6A依赖NRF2转录调节GCLC
5. ACTL6A的HR结构域对于调节GCLC和铁死亡至关重要
从结构域特征来看，ACTL6A为肌动蛋白相关基因家族的成员，在蛋白质互作中发挥重要作用。研究团队分别构建了四种缺失突变体：ΔDNBL（DNase 1结合环）突变体、ΔCC（阳离子配位）突变体、ΔNBC（核苷酸结合裂口）突变体以及ΔHR（疏水区）突变体，并转染至ACTL6A-KD细胞中。结果发现，WT ACTL6A、ΔDNBL、ΔCC和ΔNBC突变体均逆转了ACTL6A敲低对细胞增殖的抑制以及GCLC蛋白表达下降，但ΔHR突变体则没有改善效果。利用co-IP和ChIP实验，发现ΔHR突变体与NRF2无法结合，且对NRF2与启动子的结合无改善作用。进一步地，检测了ΔHR突变体对细胞ROS水平以及脂质过氧化水平的影响，同样无逆转作用。这表明，ACTL6A的HR结构域在调节GCLC和铁死亡的过程中是必需的。
图7 ACTL6A的HR结构域对于GCLC调节和铁死亡至关重要 图7 ACTL6A的HR结构域对于GCLC调节和铁死亡至关重要
6. ACTL6A-GCLC-GSH代谢轴与GC细胞铁死亡的临床相关性
研究团队利用患者来源的原发肿瘤样本植入NCG小鼠体内，结果发现，在ACTL6A高的肿瘤组织中也同样存在高GCLC表达，且细胞ROS和脂质过氧化水平较低。在ACTL6A高表达情况下使用GCLC抑制剂BSO，可延缓肿瘤进展并提高ROS以及脂质过氧化物水平。随着BSO阻断γ-GC合成过程， U-15N谷氨酰胺对GSH的总贡献下降，但对谷氨酰胺或谷氨酸水平则没有影响。而对于ACTL6A低表达的情况，抑制GCLC对肿瘤生长、ROS以及过氧化物水平影响较小。这说明，与ACTL6A低表达的肿瘤相比，ACTL6A高表达的肿瘤更依赖GSH代谢，对铁死亡诱导剂或GCLC抑制剂更敏感。最后，研究团队利用微阵列分析ACTL6A和GCLC的表达验证了上述发现的临床相关性，Kaplan-Meier分析表明，高ACTL6A和GCLC水平与较差的总体生存率相关。
研究结论
总的来说，该研究证明了含有HR结构域的ACTL6A与NRF2共同在转录水平上调节GCLC表达，通过促进GSH合成抑制GC细胞发生铁死亡。
文章来源：
Yang Z, Zou S, Zhang Y, et al. ACTL6A protects gastric cancer cells against ferroptosis through induction of glutathione synthesis. Nat Commun. 2023;14(1):4193. Published 2023 Jul 13. doi:10.1038/s41467-023-39901-8
