1实验目的：在细胞中，利用RIP的方法测定蛋白MTOR与hsa_circ_0007142是否存在互作。
2实验材料
主要试剂
试剂名称 试剂来源 cat.No
RIP试剂盒 Millipore 17-701
PMSF Genstar B111-01
磷酸酶抑制剂 Selleck B15001
蛋白酶抑制剂 Selleck B14001
反转录试剂盒 TAKARA RR037A
qPCR试剂盒 yeasen 11202ES03
主要仪器及器材
仪器名称 仪器来源 cat. No
高速离心机 enppendorf 5810R
荧光定量qpcr仪 Thermo Fisher Scientific ViiA7
3蛋白
蛋白信息
抗体：MTOR 抗体
qPCR引物序列
表1 RNA检测引物序列
4实验方法
细胞裂解液的获取
1.HTR-8冻存细胞解冻后1500rpm，离心1min，去上清。
2.每1x107个细胞加入500µl的RIPA裂解液。
3.每ml RIPA裂解液加10µl的PMSF以及磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，再加入10µl的10%SDS和tritonX-100，翻转裂解过夜，-20℃保存。
Western检测目的蛋白
1.先配置12%的分离胶，加异丙醇静置20min，待分离胶凝固，吸除异丙醇，再用水冲洗残余的异丙醇，吸水纸吸去残液。加入配置好的5%的浓缩胶，插入梳子，静置20min，待浓缩胶凝固后拔出梳子。
2.安装好电泳装置，上样，先70V,15min，后120V，90min。
3.转膜，湿转120V稳压转100min。
4.封闭，将醋酸纤维膜放入5%的脱脂牛奶中，封闭30min。
5.PBS洗膜3次，每次5min。
6.孵育一抗（1：AGO2,PBS稀释），4℃孵育过夜。
7.PBS洗膜3次，每次10min。
8.孵育二抗（1：1000，PBS稀释），室温孵育2h。
9.PBS洗膜3次，每次10min。
10.按1：1的比例加入试剂盒中的两种发光剂，孵育1min。
11. 把NC膜放到载物台，用化学发光仪进行信号采集。
磁珠与抗体结合
1.标记实验所需的1.5ml EP管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照。
2.吸取50µl重悬后的磁珠悬液于每个1.5ml EP。
3.每管加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡。
4.将1.5ml EP管置于磁力架上，并左右转动15º，使磁珠吸附成一条线，去上清，重复一次
5.用100µl的RIP Wash buffer重悬磁珠，加入约5µg 相应抗体于每个样品中，室温孵育30min。
6.将1.5ml EP管置于磁力架上，弃上清。
7.加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后弃上清，重复一次。
8.加入RIP Wash Buffer，涡旋震荡后置于冰上。
磁珠抗体复合物与蛋白结合
1.将上一步的EP管放磁力架上，去上清，每管加入900µl 表2所示的RIP Immunoprecipitation Buffer。
表2 RIP Immunoprecipitation Buffer配比
2.迅速解冻第一步制备的细胞裂解液，14,000rpm，4℃离心10min。吸取100µl上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中，使得总体积为1ml。4℃孵育3h至过夜
3.孵育完后，短暂离心，将EP管放磁力架上，去上清，加入500µl RIP Wash Buffer，涡旋震荡后将EP管放磁力架上，去上清，重复5次，总共清洗6次。
RNA洗脱
1.用150µl表3所示的Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物，55℃孵育30min。
表3 Proteinase K Buffer配比
2.孵育完后，将EP管放磁力架上，将上清吸入一新的1.5ml EP管中，于每管中加入250µl RIP Wash Buffer。
l RNA提取
1. Input样品及sense、antisense、beads 样本分别加入1ml TRIZOL, 颠倒混匀 15 s；
3. 13000 g、4℃离心 10 min，收集上层水相，转移到新无 RNA 酶离心管中；
4. 分别加入 5 µL 糖原（1ug/ul），500 µL 异丙醇充分颠倒混匀；
5. -80℃过夜沉淀 RNA 样品；
6. 13000 g、4℃离心 10 min，弃上清；
7. 分别加入 1 mL 预冷的 75%乙醇，10000 g、4℃离心 5min，弃上清，室温静置风干 10min；
8. 加入15ul DEPC处理水，溶解RNA。
l RNA反转录
1. 按照下列组分配制RT反应液（反应液制备请在冰上进行）。为了保证反应液配制的准确性，减少分装造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。
2. 按如下程序进行反转录：
37℃,15min；85℃，5sec；-20℃保存备用！
3． 定量PCR检测
1） 将Mix在4℃下融解，轻柔地上下颠倒混匀并进行短暂离心。
2） 冰上配制下表中的反应液
3）将反应管进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部。
4）采用三步法程序进行反应：
5实验结果
a. 抗体验证结果
a. qPCR验证结果及电泳图
qPCR检测结果(详细数据见附件excel” MTOR-RIP数据分析结果”)
项目内容
广州如期生物技术有限公司成立于2016年，始终以探索科学、服务客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业提供全面、便捷、专业的技术服务和产品。技术方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技术服务平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表观遗传等多个科研平台。在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降低了科研成本。
公众号：如期生物
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