文章信息
摘要
通常被认为是双种的菖蒲属（Acorus）是形成菖蒲目（Acorales）的植物属之一，与其余单子叶植物是姐妹群关系。菖蒲属的菖蒲组在欧亚大陆和美洲的全北区广泛分布，自古以来就因其强烈的药用和其他实际用途而受到重视。早期的研究将北美的原生二倍体和入侵的三倍体解释为在形态和分布范围上有所不同的两个物种。相比之下，在欧亚大陆的二倍体、三倍体和四倍体通常被解释为一个物种，因为它们据说在收藏中无法区分。我们解决了欧亚大陆和美洲之间的分类概念争议，并提供了关于温带亚洲菖蒲的首次详细多学科描述。我们使用了叶绿体和核标记、叶片解剖学、种子微观形态学、花粉可染色性、流式细胞术和直接染色体计数。二倍体和四倍体显示出稳定的分子和微观形态差异。三倍体是它们的不育杂交种，其叶绿体基因组从二倍体亲本遗传而来。亚洲和美洲的二倍体在叶性状上趋于不同。与传粉甲虫Platamartusjakowlewi和Sibirheluscorpulentus（Kateretidae科）的协同适应共存，在二倍体和四倍体之间以及在日本和西伯利亚之间4700公里的距离上得以保持。二倍体（A.americanus）是自交兼容的，可以在没有甲虫的情况下结种子。四倍体是自交不兼容的和/或不能在没有Platamartus和Sibirhelus的情况下结种子。二倍体（A.americanus）和四倍体（A.verus）是两个生物物种；前者有两个亚种。菖蒲（A.calamus）应该被限制在三倍体上；它显然最初在温带亚洲进化。二倍体主要出现在比三倍体和四倍体更冷的气候中。来自热带亚洲的A.verus和A.calamus的访问样本显然是从古老的引入中衍生出来的。我们的数据为菖蒲的药理使用提供了一个新的框架。
关键词：协同适应；隐种；进化；杂交；毛虫科；单子叶植物；形态学；传粉；多倍体；甜蔻
引言
沼生植物和河生植物属菖蒲属是被子植物中系统发育上最孤立的属之一。它形成了自己的家族和目，是其他单子叶植物的姐妹（APGIV，2016；Givnish&al.，2018；Timilsena&al.，2022）。与其他一些孤立的属相比，例如Amborella（公认的其他被子植物的姐妹），石菖蒲自古以来就以其强大的实际用途而闻名，特别是在医学方面，而且在其他方面，例如作为具有*虫活性的化合物的来源，净化水，以及仪式（Buell，1935；Motley，1994；Thompson，1995；Yao等，2008；Zemanek等，2009；Balakumbahan等，2010；Singh等，2011；Rajput&al.,2014;Shu&al.,2018;He&al.,2023;Wang&al.,2023).石菖蒲的药理作用主要与其精油有关，它还有一些重要用途，例如作为鱼麻醉剂，以最大限度地减少鱼类养殖中的处理压力和死亡率（Bhuvaneswari等，2015）。石菖蒲（甜蔻菖蒲）广泛种植用于药用、观赏和其他用途（Lokesh，2004；Tiwari等，2012；Imam等，2013；Chandra和Prasad，2017；Shu等，2018），属于菖蒲属组欧洲和北美成功的外来植物（Wein，1939；Thompson，1995；Chytrý等，2008；Vinogradova等，2009；Lansdown等，2016）。根据Scopus索引，过去10年来发表了1000多篇关于石菖蒲的论文，特别是从该属植物中提取的化合物（例如，Jaiswal&al.,2015；Bai&al.,2022；Wang&al.,2023）。最近的三篇论文在单子叶植物进化和多倍体的一般问题的背景下研究了石菖蒲属二倍体（Shi&al.,2022；Guo&al.,2023；Ma&al.,2023）和四倍体（Ma&al.,2023）成员的全基因组。令人惊讶的是，如此重要的属的基本分类仍未解决（Ma&al.,2023;Sokoloff&al.,2023a）。由于难以将基因组和生物分子归因于真实且正确命名的生物物种，基因组和生化数据的使用受到阻碍。例如，我们之前的出版物(Sokoloff&al.,2023a)中所强调的，A.tatarinowii这个名称被错误地用于仍需要作为独特物种进行评估的实体(Shi&al.,2022;Wang&al.,2023).
菖蒲属包括两个通常在物种等级上被认可的分类群：菖蒲组和禾菖蒲组（Engler,1905;Röst,1979;Bogner,2011;Boyce,2012;Sokoloff&al.,2023a）。我们在这里解开菖蒲类群的分类问题。该类群包括原产于亚洲和北美的水生（土生）植物，以多倍体系列的出现而闻名。精油（石菖蒲最重要的药物资源）的化学成分与倍性水平相关（Röst，1979；Röst＆Bos，1979；Ogra＆al.，2009；Ahlawat＆al.，2010；Mittal＆al.，2015）。十八世纪和十九世纪的分类学家观察到该类群成员之间的异质性，并主要根据叶子的大小和宽度以及花序（spadix）与tospathe比率等特征描述了10多个物种。随后的研究发现这些特征的可塑性太强，无法识别不同的物种（Engler，1905；Röst，1979；Bogner，2011；Boyce，2012）。
对北美材料的详细研究（Packer&Ringius，1984；Thompson，1995、2000，另参见Kaplan，1970）揭示了具有两种细胞型的清晰且易于解释的模式，这两种细胞型在分类学上被认为是单独的物种，即美洲石菖蒲(Acorusamericanus)（二倍体）和菖蒲（三倍体）。二倍体是本地的，主要出现在北美北部。它们有正常的种子繁殖。三倍体是由欧亚大陆的人类引入的，并被广泛归化。它们往往出现在北美较温暖的地区（Packer&Ringius，1984；Thompson，1995）。三倍体是不育的并且无性繁殖。根据Thompson(1995,2000)的说法，北美二倍体和三倍体可以使用外部叶子形态（脉络模式）在植物标本馆中轻松区分。这种识别允许精确绘制它们的分布模式（Thompson，1995）。另一方面，使用欧亚菖蒲组材料的研究揭示了更复杂的图景，包括二倍体、三倍体、四倍体和六倍体细胞型（例如，Wulff，1940、1950、1954；Röst，1978；Wang等，2001年；Mittal等人，2015年）。它们多样性的中心位于亚洲，而所有欧洲植物都被认为是引进的不育三倍体（Wulff，1940，1954；Röst，1978；Vinogradova，2004）。在亚洲，无法通过在北美有用的特征来安全地区分二倍体和三倍体（Sokoloff&al.,2021b）。Röst（1979）总结了早期文献，进行了广泛的常见园艺实验，发现区分二倍体、三倍体和四倍体的最佳特征是叶子的导气组织（通气组织）的结构。然而，除了受控条件下的常见花园实验之外，尚不清楚通气组织特征是否有用。分类学家得出结论，植物标本材料无法令人信服地区分亚洲的细胞型，并遵循Engler(1905)和Röst(1979)接受广泛的物种概念，将所有多样性置于同一多态性物种菖蒲(Kovtonyuk,1987;Tzvelev，1996；Li等，2010；Bogner，2011；Boyce，2012）。尽管在北美出现了两种形态和地理上不同的细胞型，但广泛的分类概念已扩展到新世界（Bogner，2011；POWO，2023）。
我们基于有限材料的初步研究对亚洲植物标本无法区分二倍体、三倍体和四倍体的观点提出了质疑（Sokoloff&al.,2021b,2023b）。我们相信，使用干燥的收藏品以及广泛的实地考察应该能够解决石菖蒲群的分类学问题。我们旨在回答以下问题。
1. 试图区分来自亚洲温带不同地区的大量材料的细胞型时，叶子解剖学特征的稳定性如何？
2. 果实和种子是否提供任何特征来区分二倍体和四倍体？Mayo&al.（1997）和Bogner（2011）报告了禾本科菖蒲和菖蒲之间的差异，但没有探索菖蒲的潜在变异。
3. 亚洲的细胞型分布模式是否与北美一样与地理纬度相关？
4. 三倍体是通过二倍体和四倍体之间的杂交进化而来的（例如，Bogner，2011）还是直接从二倍体细胞型进化而来，如Löve＆Löve（1957）所建议的？
5. 该群体的可育二倍体和四倍体成员之间的授粉生物学有什么差异吗？
6. 二倍体、三倍体和四倍体是否应该被视为类群？如果是，那么属于哪个等级和哪个名称？
材料与方法
植物材料——本研究使用了以下植物标本馆藏品：ABGI、ALTB、IRKU、LE、MHA、MW、TASH、VBGI和VLA。还使用了现有的数字馆藏，特别是BM、GH、K、L、MO、NY、P和US的馆藏。我们的主要关注点是亚洲温带，因为早期基于栽培材料的研究（Wulff，1954；Röst，1978，1979）表明该地区同时出现二倍体和四倍体。使用来自欧洲、热带亚洲和北美的材料进行比较。作者在俄罗斯广泛的纵向梯度（莫斯科州、阿尔泰边疆区、伊尔库茨克州、布里亚特共和国、后贝加尔边疆区、滨海边疆区）进行了实地观察和收集。植物标本馆凭证被收集，在许多情况下还补充有硅胶和70%乙醇中的样品。总共对来自316个地区的646个样本进行了研究，其中包括作者收集的52个地区（附录1、2，补充表S1A、S1B）。莫斯科和巴尔瑙尔种植了来自多个地区的材料。为了评估种群水平上叶子解剖结构的潜在变化，我们在四个模型种群（莫斯科州的三倍体、阿尔泰边疆区的三倍体和二倍体、滨海边疆区的四倍体）中的每一个中采集了至少30个单株植物的样本。
分子标记——对来自100个不同地理位置的总共115个种质进行了检查。我们研究了核核糖体DNA的内部转录间隔区(ITS1-5.8SrDNA-ITS2)和质体DNA的四个区域（psbA-trnH基因间间隔区、tRNA-Leu[trnL]内含子和trnL-trnF基因间间隔区[trnL-F]，rbcL和ndhF基因的部分）。使用DNeasyPlant迷你试剂盒（Qiagen，希尔登，德国）按照制造商说明从硅胶干燥的叶组织（用于新收集）和植物标本室材料中提取总基因组DNA。EncycloPCR试剂盒（Evrogen，莫斯科，俄罗斯）用于扩增。使用的引物和反应条件如下。对于ITS：ITS-A和ITS-B（Blattner，1999）；33个循环（30秒96°C、30秒58°C、1分钟72°C），然后是7分钟72°C。在某些情况下，两个内部引物ITS2和ITS3(White&al.,1990)用于部分扩增该区域（与ITS-A或ITS-B组合）。对于psbA-trnH间隔子，trnH2(Tate&Simpson,2003)和psbAF(Sang&al.,1997)；33个循环（30秒96°C、30秒58°C、1分钟72°C），然后是7分钟72°C。对于L-F区域，cB49317F-1和fA50272R-3（Taberlet等，1991）；33个循环（30秒96°C，30秒58°C，1分钟72°C），然后是7分钟72°C。ForrbcL:aF（Hasebe&al.,1994）和1379R（Wolf&al.,1999）；33个循环（30秒96°C、30秒52°C、1分钟30秒72°C），然后是7分钟72°C。对于ndhF：1201F（Oxelman等人，1999）和1955R_re（Ito等人，2016）；33个循环（30秒96°C、30秒52°C、1分钟72°C），然后是7分钟72°C。根据制造商提供的说明，使用CleanupMini试剂盒（Evrogen）纯化PCR产物。从制备型0.7%琼脂糖凝胶中切下后，直接或间接对每个PCR产物进行测序。DNA测序使用ABIPrismBigDyeTerminatorv.3.1，然后在AppliedBiosystems3730DNA分析仪（AppliedBiosystems，福斯特城，加利福尼亚州，美国）中进行产品分析。对所有样品的正向链和反向链均进行了测序。附录1中提供了所有新产生的DNA序列的GenBank登录号。序列在BioEditv.7.2.5（Hall，1999）中手动比对。比对可从TreeBASE获得（研究编号S31250，http://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S31250）。
流式细胞术和染色体计数——使用碘化丙啶染色的流式细胞术测定DNA含量。研究了9个二倍体群体、7个三倍体群体和26个四倍体群体（附表S1C）。总共进行了216次测量（附表S1D）。使用新鲜叶子、种子和用硅胶干燥的叶子作为样品。在补充有碘化丙啶(50μg/ml)、RNase(10μg/ml)和2-巯基乙醇(0.2%)的Tris-MgCl2缓冲液中，使用锋利的刀片将样品与标准品一起切碎(Pfosser&al.，1995）。核悬液通过孔径为50μm的尼龙滤膜过滤。在PartecCyFlowPA（Partec，德国明斯特）、Cytoflex（BeckmanCoulter，布雷亚，加利福尼亚州，美国）和LongCyte（Challenbio，中国）细胞仪上进行分析。萝卜属苜蓿‘Saxa’with2C=1.11pg(Doležel&al.,1992)被用作我们的二倍体种质的内标。来自Ust'-Kalmanka的二倍体样本（2C=0.918pg，证明人：Remizowa&al.s.n.,MW0955193）可用于直接染色体计数（Sokoloff&al.,2021b），用作DNA的内标由于与石菖蒲的尖端重叠，对石菖蒲三倍体和四倍体样品的含量进行了估计。对巴尔瑙尔培养的活体材料进行了新的直接染色体计数，并精确记录了其起源（两个二倍体种质、两个三倍体种质和三个四倍体种质）。使用16厘米长的新鲜根。在0.05M1.4-二氯苯溶液中进行预处理。使用不同的预处理策略。当根部在 4°C下置于预处理溶液中2-3小时并在下午4:00-5:00染色时，可以获得二倍体和三倍体的最佳结果。四倍体样品在 4°C下预处理过夜，并在上午8:00–9.00染色。然后根据Tanaka(1967)的规定，用1%乙酰地黄碱对预处理过的根进行染色。之后，将染色的根尖切掉并压入一滴45%的乙酸中。使用AxioImagerA2显微镜（CarlZeiss，Oberkochen，德国）观察细胞分裂的中期板并拍照。
叶子解剖学——将叶片的干燥材料在热水中再水化两天，然后转移到70%乙醇中。使用OlympusSZX-4显微镜在甘油中徒手制作并观察横截面。部分的数字图像在AdobePhotoshopElements中进行处理。总共对449株植物的叶子进行了解剖学研究。使用两个指标来描述叶通气组织的结构（有关完整方案，请参阅Sokoloff等人，2021b、2023b、c）：（1）叶片横截面之间间隔的平均细胞可见气道数量（Ncell）；(2)每0.62mm2横截面的气道数量(Ncan)。为了数据分析和呈现的目的，该指标被转换为X=1/Ncan。以下指标用于描述叶片横截面的形状。A为叶片的最大宽度（即从左侧到右侧的最大距离）；B为最大宽度处至叶片背面的距离；C是B的1/2处的层板宽度。
植物的育性——花粉染色性是菖蒲属植物育性的良好指标（Packer&Ringius，1984；Thompson，1995）。按照公布的方案（Packer&Ringius，1984；Thompson，1995；Sokoloff&al.，2023b），从49个植物标本中采集了带有花药的花朵碎片。将花粉粒置于含有乙酰胭脂红小滴的载玻片上。将载玻片在80°C下保持1分钟。然后，将载玻片置于培养皿中的湿滤纸上24小时。使用NikonEclipseCi显微镜检查载玻片。对于北美种质，花粉染色性数据取自Thompson(1995)。此外，我们还记录了191个样本中存在正常果实，作为其生育力的证据。
果实和种子结构——对代表109个地区的125个样本的种子结构进行了研究。取自植物标本室标本的干果在热水中复水两天，转入70%乙醇中，然后按照与乙醇固定材料相同的方法进行处理。为了研究种子形态，在OlympusSZX7立体显微镜下解剖果实，并在80°C的PersilDeepClean洗衣粉水溶液中处理30分钟以去除粘液。在立体显微镜下或使用扫描电子显微镜（SEM）检查种子形态。在检查之前，使用工业刀片切割一些水果和种子。扫描电镜工作是在莫斯科大学生物学院电子显微镜实验室进行的。使用以下系列将材料转移至100%丙酮：96%乙醇（两次，30分钟）、96%乙醇：100%丙酮（1:1v/v，30分钟）和100%丙酮（3次，30分钟）。30分钟）。使用HitachiHCP-2临界点干燥机（日本东京日立）对材料进行临界点干燥，然后使用EikoIB-3离子镀膜机（日本东京）镀金和镀钯，并使用CamScan进行观察S-2（剑桥仪器，英国伦敦）和JSM-6380LASEM（JEOL，日本东京）。
分布测绘——为了绘制北亚、中亚和东亚石菖蒲属物种的分布图，使用了原始数据。从最重要的早期研究中添加了一些地点，其中在叶子解剖学的背景下可靠地确定和分析了倍性水平（Röst，1978）。目前无法鉴定为二倍体、三倍体或四倍体、等待破坏性采样机会的植物标本已从绘图中省略。绘制亚洲北纬28°N以下的分布图超出了本研究的范围。
我们遵循普遍共识，即来自欧洲、土耳其和高加索地区的石菖蒲品种是不育三倍体，因为（1）它与我们在此研究的材料的数据非常吻合，（2）文献中提供了来自该区域的大量直接三倍体染色体计数（Röst，1978；Baytop，1979；Petersen，1989；Oganezova＆Barsegian），1999；Vinogradova，2004以及其中引用的参考文献），以及（3）在众多检查的植物标本中都没有发现带种子的果实。我们从GBIF(https://doi.org/10.15468/dl.hf3gyr)下载了欧洲及邻近地区菖蒲数据集，并手动检查以删除错误识别为菖蒲的集合。植物区系文献中还添加了一些额外的明确地点（Grossheim，1940；Mill，1984；Tzvelev，2000；Zając&Zając，2001；Kravchenko，2007；Murtazaliev，2009；Yurova等，2009；Sarić-Kundalić等）.，2010；Bartha等，2023）。未经过馆藏证实的非常古老（>150年）的文献报告，以及明显是最近引入的记录，不予考虑。
我们遵循Thompson(1995)关于北美区分二倍体和三倍体的标准的详尽研究。我们下载了美洲菖蒲(https://doi.org/10.15468/dl.v87eg7)和菖蒲(https://doi.org/10.15468/dl.bvpcg2)标本的GBIF数据集。GBIF记录经过手动检查，以确保它们遵循Thompson(1995)的概念。所有不明确的条目已被删除（例如，Thompson未提及且缺乏可用图像的条目），并且一些明确的条目已被重新分类。来自公园（例如纽约中央公园）的种质不包括在内，因为它们的起源较新。我们的手动控制显示缺乏一些州和省的数据。这些是使用Thompson(1995)中的样本列表添加的。
分布图是使用Windows版DMAP创建的（A.Morton；https://www.dmap.co.uk）。
授粉生物学——Funamoto等人。(2020a,b)研究了日本石菖蒲群成员的生殖生物学，并描述了两种甲虫物种Platamartusjakowlewi和Sibirheluscorpulentus(Kateretidae)授粉后的果实。为了弄清楚菖蒲科范围内的菖蒲科甲虫和石菖蒲植物之间的相互作用有多稳定，我们研究了俄罗斯阿尔泰边疆区乌斯季卡尔曼卡附近的一个地区的授粉生物学（52.08498°N，83.29757°E）。首先，这里是欧亚大陆距日本最远（约4700公里）的肥沃石菖蒲产地之一。其次，我们早期的研究表明，乌斯季卡尔曼卡地区的植物是二倍体（Sokoloff等，2021b）。Funamoto&al.(2020a,b)没有报告其石菖蒲植物的倍性水平，但其他报告表明来自日本的所有可育植物都是四倍体（Röst，1978；Petersen，1989）。2021年6月20日至23日期间对乌斯季卡尔曼卡的花植物进行了观测。选择了30个花序进行详细监测。通过视觉和数码相机（PentaxOptioW80、Canon70D和HC-VX1）记录花卉访客。总计超过30小时的目视观察、21小时的视频录制以及拍摄了325张照片。用排气器捕捉访问花朵的昆虫，并分别固定在1.5ml试管中的95%乙醇中。总共收集了74只花的访客个体，其中55只用于计数其身上的花粉粒，19只用于解剖。进行解剖是为了评估消化道中石菖蒲花粉粒的存在。如下对收集到的昆虫的身体上的花粉粒数进行计数。将昆虫转移到新试管中；原管以3000rpm离心10分钟。使用Micromed-3（中国浙江宁波盛恒光学电子公司）光学显微镜检查沉积物的临时制备物。石菖蒲属和其他植物物种的所有花粉粒均单独计数。进行了自主自花授粉测试，使用纺粘茶袋分离出30个花期前的花序。分离后两个月（2021年8月16日），对分离花序和自由授粉花序进行坐果分析。在乌斯季卡尔曼卡以及俄罗斯的其他一些地方对与果花序相关的昆虫进行了观察。
分类学和命名法——我们认为，理想情况下，应该使用不止一种独立的证据线（包括形态学和分子系统发育标记）来精确地区分物种。我们更喜欢对具有部分重叠形态变异模式的地理定义实体使用亚种等级。
在结果部分逐步呈现所有证据之前，我们避免得出任何分类学结论。我们首先识别核糖体型和质体单倍型，然后证明它们的出现与倍性水平、植物育性和种子形态类型精确相关。根据这些离散的特征，我们识别出I、II和III组。我们讨论了叶子解剖学的定量特征以及将样本分为I-III组的情况。叶子的形态和解剖学以及分布模式使我们能够提出亚组IA和IB。掌握所有数据后，我们得出结论，这三个类群应被视为物种，而亚类应被视为亚种。
接受的分类单元根据植物命名规则命名（Turland&al.,2018）。石菖蒲几个物种名称的典型化是在其他地方进行的，利用解剖学、外部植物形态和孢粉学的间接证据推断原始材料的倍性水平（Sokoloff&al.,2023a,b,c），并基于石菖蒲的历史植物标本室收藏（Sennikov，2024）。这些论文中提供的详细命名讨论此处不再重复。
结果
分子标记——菖蒲组成员的所有可用nrITS序列的比对长度为696bp。在我们的材料中发现了两种明显不同的nrITS核糖型（核糖型I和核糖型II）。这两种核糖型的差异多达12个单核苷酸取代加上10个插入缺失（附录3）。来自41个地区的样本仅具有I型核糖核酸。这些样本采集于西伯利亚（俄罗斯：阿尔泰边疆区、新西伯利亚州、托木斯克州、图瓦、克拉斯诺亚尔斯克边疆区、伊尔库茨克州、布里亚特、后贝加尔边疆区、萨哈共和国[雅库特]）和远东（俄罗斯：阿穆尔州、滨海边疆区）以及蒙古和美国（附录2）。GenBank序列（FJ874929、FJ874928）鉴定为北美二倍体A.americanus，也属于核糖型I（附录3）。来自34个地区的标本仅具有核糖型II（附录2）。其中大部分是在滨海边疆区采集的，但也有一个来自哈巴罗夫斯克边疆区的样本和一个来自印度的样本（栽培种，科尔哈布尔，马哈拉施特拉邦）。基于印度、中国和韩国南部材料的GenBank序列也属于核糖型II（附录3）。我们在我们的材料中发现核糖型I和II内没有序列变异。中国和韩国的GenBank核糖型II序列存在细微差异，但印度序列KM887399与我们的核糖型II序列相同（附录3）。来自不同地区的25个样本显示核糖体I型和II型同时出现。这些标本采集于白俄罗斯、乌克兰、俄罗斯欧洲部分（别尔哥罗德、布良斯克、卡卢加州、利佩茨克、莫斯科、斯摩棱斯克、弗拉基米尔、沃罗涅日、雅罗斯拉夫尔州）、哈萨克斯坦、西伯利亚西南部（阿尔泰边疆区）和美国（附录2）。A.gramineuss.l.的GenBank序列。显示菖蒲组核糖型I和II特征的镶嵌特征（附录3）。
在此研究的四个质体标记中，psbA-trnH和trnL-F比ndhF和rbcL提供了更多信息位点。石菖蒲组的比对结果为：rbcL为1289bp，trnL-F为973bp，ndhF为733bp，psbA-trnH为409bp。我们的材料中的每个质体标记都发现了两个单倍型（附录4）。根据psbA-trnH的变异，单倍型II有多种亚型（见下文）。所有具有核糖型I的种质，以及所有同时出现两种核糖型的种质，在此研究的质体标记中都是同质的。因此，我们将它们的质体序列指定为单倍型I（附录2、4）。所有具有核糖型II的种质都拥有另一种质体单倍型（单倍型II）。未发现不同质体标记的数据之间存在冲突（附录4）。两种单倍型之间的差异包括ndhF中的单个核苷酸替换、rbcL中的两个核苷酸替换、trnL-F中的单个核苷酸替换加上三个相邻比对位置的差异以及psbA-trnH中的两个特征。psbA-trnH的所有单倍型II序列与单倍型I的不同之处在于，在比对位置182-236中存在25bp长（而不是55bp长）的片段，在位置366-377中存在更长的多聚A片段（附录4））。所有单倍型II序列都具有这些特征。psbA-trnH比对的其他位置的变化允许识别单倍型II内的亚型（附录4）。单倍型IIa是常见的一种。在滨海边疆区检查的大多数种质以及来自印度（补充表S1A、S1B）。单倍型IIb、IIc和IId与单倍型IIa的不同之处在于特定的缺失（附录4）。单倍型IIb在距兴凯湖南岸和西岸30公里范围内的四个分散种质中被发现。在同一地区的另一个种质中发现了单倍型IIc。请注意，来自这个采样良好的区域的大多数检查种质都具有单倍型IIa。单倍型IId是在哈巴罗夫斯克边疆区唯一具有核糖型II的检查样本中发现的（补充表S1A、S1B）。
流式细胞术和染色体数量——在本节中，我们将新发现与我们早期出版物（Sokoloff等人，2021b，2023c）中的数据相结合，如补充中所示。表S1C。
基于阿尔泰边疆区两个种群的直接染色体计数（Remizowa&al.s.n.，MW0955193，Sokoloff&al.，2021b；Skaptsov&Smirnovs.n.，ALTB1100044065，本研究）揭示了染色体数目2n=2x=24（图1A））。该材料和来自俄罗斯亚洲地区的其他七个样本（包括六个新采样的群体）的核DNA含量相似（2C=0.881至0.945pg）。因此，我们得出结论，所有九个集合都是二倍体（补充表S1C）。他们来自东西伯利亚（伊尔库茨克州、布里亚特和后贝加尔边疆区）和俄罗斯远东地区（滨海边疆区）（附录2）。分子数据揭示了此类集合中核糖型I和质体单倍型I的出现（附录2）。
阿尔泰边疆区的直接染色体计数（Skaptsovs.n.，ALTB1100043704，本研究；Remizowa&Sokoloffs.n.，MW0955188，本研究）揭示了染色体数目2n=3x=36（图1B）。该材料的核DNA含量与来自阿尔泰边疆区的其他三个样品以及来自莫斯科州和哈萨克斯坦的样品相似（2C=1.232至1.307pg）。因此，我们得出结论，所有六个集合都是三倍体，2n=3x=36（补充表S1C）。还有一个来自阿尔泰边疆区的样本（Remizowa&al.s.n.,MW0955192），其直接染色体计数为2n=3x=33，2C数在1.135至1.206pg之间（Sokoloff&al.,2021b）。三倍体种质具有质体单倍型I和两种核糖体型（附录2）。
所检查的三倍体种质中没有一个具有比二倍体计算的平均值高1.5倍的核DNA含量值。二倍体和三倍体（非整倍体样品不计在内）的平均值之比为1:1.37（表1）。三倍体的平均基因组大小与二倍体和四倍体基因组大小总和的一半非常一致。
图1.非门控流式细胞术直方图和染色体数目直接计数的示例。A，二倍体，俄罗斯（阿尔泰边疆区），Remizowa等。序列号（MW0955193）；B，三倍体，俄罗斯（阿尔泰边疆区），Skaptsovs.n.（ALTB1100043704）；C，四倍体，俄罗斯（滨海边疆区），Remizowa和SokoloffD32（MW0963235）；D、二倍体、三倍体和四倍体样品组合，Remizowa等。序列号(MW0955193)，Remizowa等。序列号(MW0955187)和Remizowa和SokoloffD32(MW0963235)；E，四倍体植物的种子，Remizowa和SokoloffD23(MW0963228)；F，具有主峰和一个小的附加峰的混合倍体样品的直方图（对数标度），Sokoloff等人。I-17(MW0758480)。—D–F中的直方图包含侧向散射与PI荧光的点图。R.s.，内标Raphanussativus‘Saxa’(2C=1.11pg)；2x，来自Ust’-Kalmanka的二倍体样品，用作三倍体和四倍体样品DNA含量估算的内标。比例尺=10μm。
直接染色体计数揭示了c的发生。来自滨海边疆区的两个样本中的48条染色体（Marchuks.n.,Remizowa和SokoloffD32，本研究，图1C）。我们早期的研究揭示了来自印度的样本中至少有44条染色体（Sokoloff&al.I-17,Sokoloff&al.,2023c）。因此，这些集合是四倍体。基于流式细胞术，我们得出的结论是，除了一个例外，这里研究的滨海边疆区的所有其他样本也是四倍体（附录2）。在此检查的所有四倍体样品中，核DNA含量(2C)从1.473到1.613pg不等（补充表S1D）。这里检查的所有四倍体样品的平均核DNA含量为1.551pg，比二倍体平均值高1.69倍（表1，另参见图1D）。这个数字远低于预期的两倍差异，但我们材料的四倍体性质得到了直接染色体计数的支持（图1C）。
对流式细胞术数据的详细分析揭示了一些四倍体种质的叶子样品中出现两个间隔很近的峰（图1F），这可以解释为具有c的不同细胞的混合倍体性的证据。c.44和c.48条染色体。2C值是使用此类样品中的主峰计算的。
除了基于叶材料的流式细胞术数据之外，还对两个二倍体和三个四倍体种质的新鲜种子进行了检查。在所有情况下，都发现了两个DNA值比为2:3的峰，表明二倍体种质中出现三倍体胚乳，四倍体种质中出现六倍体胚乳（图1E）。
花粉染色性和坐果性——我们使用两个来源推断植物的育性：花粉染色性和坐果性。具有正常果实和种子的植物被认为是可育的。没有果实不被认为是植物不育的直接证据。当样品中的大多数花粉粒被染色时，我们认为该样品是可育的；当大多数谷物没有染色时，样品被认为是无菌的。
当流式细胞术数据可用时，未染色花粉的样品是三倍体（附录2）。当分子数据可用时，非染色花粉样品具有nrITS核糖型I和II以及质体单倍型I的组合（附录2）。当可获得生育力数据时，仅具有一种nrITS核糖型的种质以及使用流式细胞术或直接计数推断为二倍体或四倍体的种质总是可育的（附录2）。这种植物的坐果规律，在温带地区很常见。作者在阿尔泰边疆区、布里亚特共和国和滨海边疆区实地考察的种群中，几乎所有花序都结出果实。
尽管对植物标本馆藏品以及活体植物的可用地理参考图像数据集进行了广泛的搜索(https://www.gbif.org/https://www.inaturalist.org/)，但没有发现来自热带地区的结果植物。成立。拥有丰富藏品的热带地区包括中国南部（云南、四川）、泰国、印度、不丹、尼泊尔、印度尼西亚和新几内亚。一些热带品种，尤其是在印度半岛低海拔地区种植的品种，很少开始开花。在海拔700m以上采集并具有花序的花序藏品绰绰有余，但没有一个藏品具有种子发达的果实。与此同时，来自云南、印度和不丹的学生在这里和Sokoloff等人学习。(2023b)花粉染色性具有良好染色的花粉。
水果和种子形态——水果和种子的图解描述在补充中提供。附录S1。在这里，我们集中讨论区分二倍体和四倍体种质的性状。我们识别两种种子形态类型。在推断为二倍体且带有核核糖核酸型I的种质中发现了形态型I（附录2）。在推断的四倍体和带有核核糖核酸型II的种质中发现了形态型II（附录2）。
在种子形态I中，种皮的珠孔端较宽（图2A-H）。如果其远端叶是直的，则通过远端开口可以清楚地看到远端的狭窄尖端（图2F-H）。如果种皮的远端叶向内弯曲，远端开口就会关闭（图2E）。在这两种情况下，种皮的浅裂边缘仅具有那些在开花时已经出现的短（0.03-0.13毫米）多细胞毛（图2E-K）。种皮游离远端部分的内表面无毛（图2J）。
在种子形态II（图3）中，种皮的远端开口很窄，并且从外部看不到种皮的尖端（图3H）（图3A-C，E-G）。成熟种子中种皮远端边缘有时仍可见开花时形成的短多细胞毛（图3G、H）。与种子形态型I最重要的质量差异是在种子发育过程中在其内侧外珠被的自由部分的基部存在长毛。附件的模式在图3D中最为明显。这些细胞毛长0.2-1毫米；每颗种子中至少有一些毛长度超过0.4毫米。长细胞毛形成一束，从Tegmen顶端的开口处出现（图3A-C，E-G）。捆束倾向于作为一个整体扭曲。大多数（尽管不是全部）长细胞毛的远端部分是分叉的，并且一根或两根分支向后弯曲（图3A-I、K）。有时长细胞毛以更复杂的方式分叉。例如，记录了两次分叉的长细胞毛（图3J）。
表1石菖蒲检查材料中DNA含量和染色体数量的数据（完整的主要数据参见附表S1C和S1D）
一般叶子形态——营养叶沿着根茎呈二列排列，并具有鞘基部和剑状叶片。叶片垂直变平。它具有左侧和右侧以及尖锐的近轴和远轴边缘。顶生花序（spadix）与称为佛焰苞的叶子相关。花序前最后一片营养叶腋中的分枝继续根茎生长。树枝的叶瓣有两个垂直扁平椎板的近轴侧有龙骨，背面有锐角边缘。营养叶的佛焰苞和叶片之间在形态和解剖学上没有发现实质性差异。我们重点研究最长营养叶最宽部分的解剖结构。当只有佛焰苞可用时，对其解剖结构进行了研究。在横截面中，叶片具有外围的绿色组织带和中央的通气组织。大多数维管束位于叶面附近。从横截面可见，通气组织具有由单细胞层隔膜隔开的多边形气道。
图2种子珠孔侧的微形态(SEM)–形态类型I(Acorusamericanus)。A–D，珠孔面朝下的视图：A，俄罗斯（布里亚特），Turczaninows.n.（LE01082871）；B、布里亚特、图尔恰尼诺s.n.(LE01082856，A.triqueter的等选型)；C，蒙古（南非），Baizragg等。6288（和01192963）；D，中国（内蒙古），Litvinov427(LE01192967)。E-H，珠孔侧的视图：E，俄罗斯（阿尔泰边疆区），Vislobokov21045（MW0963268）；F，俄罗斯（雅库特），Kuvaev106（MW0037503）；G、布里亚特、亚速和韦尔霍齐纳s.n.（MW0160192）；H，俄罗斯（阿穆尔州），Nikiforovas.n.（MW0037499）。I&J，阿穆尔州，Nikiforovas.n.(MW0037501)：I，珠孔侧右侧，珠孔外种皮部分去除；J，（I）中去除的种皮碎片的内侧。K、布里亚特、斯卡普佐夫等。序列号(MW0967111)：种子的非正中纵向切口，珠孔侧。—dlt，种皮远端裂片；es，胚乳；ps，外胚乳；tg、tegmen；ts，种皮；tt，tegmen的珠孔尖端；箭头，外种皮浅裂边缘的非常短的毛。比例尺=100μm。
叶通气组织的特征——此处检查的373个石菖蒲标本的通气组织解剖学指标（X和Ncell）的数据均可用（图4A）。为了分析叶片通气组织，我们按以下方式指定了三组样品。对于第I组种质，至少记录了以下条件之一：二倍体、不存在核核糖型II和存在种子形态型I。第II组根据四倍体、质体单倍型II的出现和种子形态型进行指定。最后，第III组的标记是三倍体、核糖核酸型I和II的共现以及植物不育。根据这个定义，I组中的Ncell范围为2.95至7.80，II组中的Ncell范围为0.5至3.18，III组中的Ncell范围为1.85至4.55（图4B）。为了进一步讨论，当其他性状数据不可用时，Ncell超过4.55的数字被认为足以将样本放入第一组；Ncell值低于1.85被用作将样品归入第II组的证据（附录2）。尽管Ncell的变异范围由于I组和II组略有重叠，因此可以使用此特征将绝大多数检查样本在两组之间进行分类（图4B、5A）。
图3种子珠孔侧的微形态(SEM)–形态类型II(Acorusverus)。A-H，珠孔侧朝下的视图（D，部分去除珠孔外种皮；H，种子的中位纵向切口）。I-K，受精后发育的长毛状体的细节。A，俄罗斯（阿穆尔州）Leshchinas.n.（MW0037492）；B&I，俄罗斯（滨海边疆区），Zhurba292(MW0037502)；C，滨海边疆区、雷米佐瓦和索科洛夫D32（MW0963235）；D&K、滨海边疆区、雷米佐瓦和索科洛夫D29(MW0963214)；E&J、滨海边疆区、雷米佐瓦和索科洛夫D23(MW0963228)；F，滨海边疆区、雷米佐瓦和索科洛夫D09(MW0963228)；G&H，滨海边疆区，Remizowa和SokoloffD06(MW0963236)。—lh，受精后形成的长毛；tg、tegmen；ts，种皮；tt，tegmen的珠孔尖端；箭头，外种皮浅裂边缘的非常短的毛。比例尺=100μm(A–H)、30μm(I–K)。
对于第Ⅰ组，可以获得乌斯季卡尔曼卡附近阿尔泰边疆区某个地区人口水平变化的数据。这些数据是在2019年和2021年两年内收集的。这两个季节在乌斯季卡尔曼卡发现的通气组织解剖特征的总体变异范围接近第Ⅰ组所有检查地点的变异范围（图5A）。同时，2019年和2021年采集的样本之间也存在显着差异。种群规模小而紧凑，这种差异不太可能因其潜在的异质性而产生偏差。更有可能的是，这种差异与这两年当地的天气状况有关。两个地方都可以获得第Ⅱ组的人口水平数据，并且II组内的总体变化（图5A）。显示变异范围比第Ⅰ组更窄。III组的两个种群（来自俄罗斯欧洲部分的莫斯科州和西西伯利亚的阿尔泰边疆区）表现出不重叠的变异范围（图5B）。然而，我们在其他地区的数据表明，这些差异不能概括为区分第Ⅲ组欧洲和亚洲种质（图5B）。
图4 叶片通气组织变化的定量数据。Ncell是叶片横截面中可见的气道之间的隔膜中细胞的平均数量。X=1/Ncan，其中Ncan是横截面为0.62mm2的两个区域中根管数的平均值。A，研究中包含的所有样本。插图显示0.62mm2区域内的通气组织解剖结构的代表性图像。左：四倍体（Remizowa和SokoloffD32）。右：二倍体（Vislobokov21045）。每个图像附近都提供了图表中使用的两个值的计算示例B，使用叶子解剖学以外的特征识别的三组Ncell值的估计累积概率。主要数据：补充在表S1B。
叶片横截面的形状——II组的种质显示出以下叶片横截面特征（图6A-K）。横截面的中心部分的轮廓为菱形。菱形的左边缘和右边缘各有该椎板一侧最大的维管束，或一组紧密间隔的维管束。菱形的近轴和远轴边缘延伸成翼。在横截面中，这些可以被视为带有非常有限的通气组织的薄突出物。通气组织通常不会延伸到突起的末端；它也经常在大维管束附近中断。从横截面来看，近轴投影比远轴投影长（即，在叶子的侧视图中，近轴翼比远轴翼宽）。
图5 叶通气组织的群体水平变异与此处识别的三个群体（物种）内的总体变异范围相比。指标如图4A所示A，属于第一组和第二组的样品；B，属于第三组的样品。主要数据：补充在表S1B。
图6 叶片的横截面。A–K，第二组，亚洲（Acorusverus）；A，俄罗斯（滨海边疆区），Verkholat8619(VLA58316)；B，滨海边疆区，列利科夫673(MHA0293814)；C，印度（马哈拉施特拉邦），Sokoloff等。I-17(MW0758480)；D，滨海边疆区、雷米佐瓦和索科洛夫D09(MW0963228)；E、滨海边疆区、雷米佐瓦和索科洛夫D18（MW0963254）；F，滨海边疆区，Choi等。9046（VLA）；G，滨海边疆区，Nechaevas.n.（VLA84224）；H，俄罗斯（犹太AO），Raddes.n.（LE01249698）；I，印度（锡金），Treutler941(LE01082880)；J，滨海边疆区，克雷斯托夫D70（MW0963249）；K，俄罗斯（阿穆尔州）Leshchinas.n.（MW0037492）。L–V，IA组，亚洲（Acorusamericanussubsp.triqueter）；L，俄罗斯（布里亚特），Skaptsov等。序列号（MW0967111）；M，俄罗斯（伊尔库茨克州），Blagoweschtschensky739(LE01249832)；N，俄罗斯（哈巴罗夫斯克边疆区），Syralev176(LE01249715)；O，俄罗斯（新西伯利亚州），Busurmanovas.n.（LE01249653）；P，俄罗斯（克拉斯诺亚尔斯克边疆区），Verkhovskaya&Mishin522(LE)；Q，克拉斯诺亚尔斯克边疆区，Martyanov1107(LE)；R，俄罗斯（滨海边疆区），Krestov等。D50（MW0963229）；S，俄罗斯（雅库特），Kuvaev&Nikolaev65/7(MW0037505)；T，俄罗斯（托木斯克州），Utkin376(LE01249658)；U，俄罗斯（阿尔泰边疆区），库兹涅佐夫和迪卡列夫s.n.（ALTB）；V，蒙古（多诺德），Gubanov5761（MW0172576）。W-Y，IB组，北美（Acorusamericanussubsp.americanus）；W，美国（佛蒙特州），Krasnoborov&Molchanov534（MHA）；X，加拿大（安大略省），Garton8137（MW0572410）；Y，加拿大（马尼托巴省），Scoggan9180(LE01249878)。–比例尺（所有图像通用）=1毫米。
在I组的材料中（图6L-Y），横截面的中心部分，或者有时整个横截面，轮廓是椭圆形的。正面翼，特别是背面翼及其通气组织的发育程度各不相同。在极端情况下，双翅或背面的翅都消失了。在叶片两侧横截面最宽的部分中可以识别或无法识别出明显的大束。第三组的种质表现出介于第一组和第二组之间的一系列变异。
叶片横截面形状的定量分析（不考虑维管束）揭示了一个图表，其中组I和组II的种质形成两个明显且仅略微重叠的云（图7）。可以预见的是，在我们的图表中，第III组的大多数种质都位于第I组和第II组的云层内（图7）。为了评估I组内潜在的地理差异，其亚洲种质被指定为IA组（图6L-V），北美种质被指定为IB组（图6W-Y）。在我们的图表中，IA组和IB组的云虽然重叠，但明显不同（图7）。值得注意的是，美国种质（IB组）与II组和III组明显分开。除一个例外（Ahles82704，LE01249864）外，美国种质的C/A比率超过0.4，而第二组和第三组的比率低于此数字。这两种情况均在IA组中发现（图7）。我们发现IA组种质之间没有明显的地理变异模式（无论是横向还是纵向）。特别是，来自亚洲的最东（或最北）种质没有表现出与美国IB组更加相似的明显趋势（图7）。
叶脉图案——除了叶子解剖学之外，还使用干燥的植物标本室材料及其数字图像检查了该特征。我们证实了Thompson(1995)的早期发现，即北美材料可以根据叶脉分为两组。在一个组中，其成员结出正常发育的果实（Thompson，1995解释的美洲石菖蒲；本研究的IB组），叶片的每一侧都有几条同样大的静脉或一两个静脉略多于其他静脉（图8A）–L）。当存在稍大的叶脉时，其在植物的叶子中通常是不稳定的（图8D、F、I、J）。在另一个北美群体中，其成员从未用种子结出果实（汤普森的菖蒲，本研究的第三组），叶片具有明显的次生中脉（术语：Kaplan，1970），两侧都有一个大束（植物标本室标本展开的叶子中只有一侧可见）。在欧亚大陆，使用相同字符区分两个实体是有问题的。次生中脉在第二组的所有标本和第三组的几乎所有标本中都很明显。在属于我们第一组的亚洲种质中，次生中脉大多很明显（图8P-T），但有时不明显（图8N，U），并且该特征的变化是定量的而不是定性的。
分布范围——在北美，I类（二倍体）的分布范围比III类（三倍体）的分布范围要更向着北边得多，但分布范围有相当大的重叠（图9A）。我们将来自科罗拉多州丹佛市落基山湖公园的记录识别为I组(https://www.inaturalist.org/observations/89856553)，远远超出了图9A所示的范围。这些植物很可能是在城市公园生长时引入的。我们无法获得来自加拿大安大略省多伦多海帕克(McIntosh&Catlings.n.,TRT)的标本，但Thompson(1995)提供了令人信服的证据，表明这是引入的四倍体。
欧洲III组的范围覆盖了该大陆的大部分地区，不包括伊比利亚半岛以及该大陆的最南部、北部、东北部和东部地区（图9B）。该群并不出现在伏尔加河谷经向部分以东。伏尔加河口附近的地区与欧洲石菖蒲更连续分布的地区分离。石菖蒲也有记录，但在欧洲西北部纬度63°以上的地区很少见（图9B）。这与北美第三组的范围形成鲜明对比，后者的范围不超过北纬46.1°（美国缅因州）。欧洲和温带亚洲的第三组范围之间存在差距。尽管车里雅宾斯克州有记录（Kulikov，2010）我们无法核实，但乌拉尔河流域的乌拉尔山脉几乎没有石菖蒲属。在西西伯利亚和哈萨克斯坦北部，额尔齐斯河和鄂毕河沿岸以及一些邻近地区记录到了第三组。尽管这种植物在洪泛区草甸中很常见，而且在高水位时根茎可以很容易地被带到这些河流的下游，但在额尔齐斯河盆地的北纬60°N及更高纬度地区没有石菖蒲。该属在欧洲和西伯利亚的这些纬度地区很常见（图9B）。有一些关于额尔齐斯河盆地石菖蒲的文献记录，这些记录来自此处未采样的地点，但所有这些记录都来自纬度低于60°的地区（Sviridenko&Pereladova，2005；Kharitontsev，2010）。根据我们的数据，第三组在西伯利亚西南部和哈萨克斯坦东北部以外的亚洲温带地区很罕见（图9D）。
I组是东西伯利亚和蒙古石菖蒲的唯一代表（图9B）。最西边的地点位于鄂木斯克州（值得注意的是，这里发现了一种不寻常的叶子通气组织状况，图5A）。第一类植物主要生长在相对较小的湿地，通常与阿尔泰边疆区所谓的带状松林有关。与第三类植物相反，阿尔泰边疆区大型鄂毕河漫滩中没有记录到它们。I组最北端位于雅库特中部勒拿河流域（阿尔丹河北纬63.2°）。这可以与北美I组的不连续最北记录（阿拉斯加，北纬64.9°）进行比较。I组最东端和不连续的记录位于堪察加半岛中部，而其最南端位置是在本研究中在北纬44.1°的滨海边疆区发现的（图9C）。这个地方的植物很弱，数量很少，全是营养植物。我们在滨海边疆区任何其他地方寻找I类植物的特别尝试均未成功。
亚洲温带第二类植物的分布范围为北纬31.4° ~51.5°和东经109.8°~145.7°（图9B、C）。四倍体在山区也很常见，对某些范围来说，热带亚洲低地，向南延伸到印度尼西亚，向西延伸到印度，但我们在热带收藏中没有发现结果植物。我们没有足够的数据来将自发事件与热带地区栽培四倍体的记录分开。
图7 层板横截面形状的定量分析。左上，分析主图IA组和II组包括来自亚洲的标本。IB组包括北美标本。第三组包括来自欧洲、亚洲和北美的标本。主要数据：补充。表S1B。右上，代表性横截面（第一组；俄罗斯、布里亚特、Skaptsov等），解释了变量A、B和C的含义（另见材料和方法）。底部，相同分析的图表，其中根据其所在地的地理纬度和经度分组的种质。
图8 北美石菖蒲(A–M,subsp.americanus;IB组)和亚洲(N–U,subsp.triqueter;IA组)成员(本研究的I组)的叶脉模式;A，美国，明尼苏达州，Mearnss.n.（美国03816871）；B，美国，密歇根州，Camp&Camps.n.（美国03816880）；C，加拿大西北地区，Thieret9484（US03816875）；D，加拿大，安大略省，Garton2163（US03816877）；E，美国，缅因州，Ogden&Steinmetz2473（US03816883）；F，美国，明尼苏达州，沃德s.n.（美国03816893）；G，美国，明尼苏达州，Grant2953（US03816887）；H，美国，俄亥俄州，Pieterss.n.（美国03816892）；I，美国，爱达荷州，Rust1070（US03816896）；J，美国，爱达荷州，Leiberg1278（US03816897）；K，美国，威斯康星州，哈特利1412（US03816899）；L，加拿大，安大略省，Fowlers.n.（美国03816901）；M，美国，明尼苏达州，Andersons.n.（美国03816902）；N，俄罗斯，阿尔泰边疆区，雷米佐瓦等。序列号（MW0955197）；O，俄罗斯，后贝加尔边疆区，柳博戈辛斯基C776(IRKU022541)；P，俄罗斯，布里亚特，Turczaninows.n.（LE01082852）；Q，俄罗斯，图瓦，Shaulo13a(MW0167518)；R，俄罗斯，图瓦，Shaulo54(MW0167517)；S，俄罗斯，雅库特，Tikhomirovs.n.（兆瓦0953300）；T，俄罗斯，克麦罗沃州，布科等。序列号（KUZ008324）；U、蒙古、Dornod、Gubanov等。964(MW0172573)。—比例尺(1cm)对所有图像都是通用的。
图9 此处识别的三个类群（物种）的地理分布。A&B，像元大小为85′E-W/60′N-S的网格地图。双色圆圈表示已记录两组的正方形。C&D，带有个人记录的地图。(C)和(D)所覆盖的亚洲地区如(B)所示
生殖生物学——现场观察以及在花期收集的检查植物标本的数据一致地揭示了属于I、II和III组的种质中花和整个花序花序水平的原雌性。
对乌斯季卡尔曼卡（阿尔泰边疆区）IA类（可育二倍体）植物的详细观察表明，昆虫在整个白天都会光顾花序。补充表S2A和S2B提供了花卉访客的数据。花序的雄性花序有多种甲虫（瓢虫科、隐噬虫科、象甲虫科、Nitidulidae、Kateretidae）、双翅目昆虫（角蠹科、摇蚊科、氯虫科、蝽科）以及偶尔的膜翅目昆虫、臭虫、蚜虫、跳虫和蜘蛛。Platamartusjakowlewi和Sibirheluscorpulentus甲虫（Kateretidae科）是雄性花期最常见的来客（图10A-C、E、G）。同样的卡特里蒂科甲虫在雌性花期也很常见（图10D，F）。所有其他昆虫访客在雌性阶段都很罕见。其中包括叶甲科甲虫和一种身份不明的双翅目昆虫（补充表S2A、S2B）。
当访问花序时，甲虫通过吃花粉和柱头分泌物表现出摄食行为。他们还利用花序作为避难所，在佛焰苞腋内停留很长时间（图10F）。在石菖蒲花序上记录了交配的西伯利亚甲虫（图10E，G）。在13只解剖的Platamartus甲虫和所有4只解剖的Sibirhelus甲虫的内脏中发现了石菖蒲花粉。
对花卉访客身体表面冲洗物的研究表明，Platamatus和Sibirhelus甲虫是乌斯季卡尔曼卡石菖蒲最有效的传粉媒介（图11；补充表S2C）。在这些甲虫身上发现的石菖蒲花粉的累积量远高于在雄性和雌性开花期记录的任何其他访客的数量。此外，没有发现其他来客群体在雄性和雌性阶段访问花序时携带石菖蒲花粉（图11）。由于形态上的独特性，可以明确鉴定样品中的石菖蒲花粉。没有卡特里特蜂访客携带的不属于石菖蒲属的花粉数量超过可忽略不计的10粒（附表S2C）。
对乌斯季阿莱卡（阿尔泰边疆区）的III组植物（不育三倍体）的观察显示，在雄性或雌性花期没有甲虫来访。花客很少（主要是苍蝇和蚂蚁），并且不携带石菖蒲花粉。
在自由授粉监测的40个可育二倍体(Ust’-Kalmanka)花序中，有32个花序发育出果实，超过50%的花中含有种子。其余8个花序中的一些发育出分散的果实。14个独立花序中的1个花序在超过50%的花中发育出果实，而8个花序在少于50%的花中发育出果实。对自由授粉时不育三倍体（第III组）的观察表明，所有花中完全没有任何正在发育的种子（在阿尔泰边疆区乌斯季阿莱卡观察到59个花序，在阿尔泰边疆区阿莱斯克观察到77个花序）。2021年8月和2022年对滨海边疆区II类植物（可育四倍体）的实地观察显示，在各地几乎所有检查的花序中，超过50%的花朵都发育有种子。
I组植物（取自布里亚特巴尔古津河附近自然种群的材料，Skaptsov等）与莫斯科任何其他可育植物完全隔离栽培，于2023年仅产生一个花序，并正常发育果实。几乎每朵花都有种子自由授粉。这些种子的流式细胞术显示出两个比例为2:3的峰，表明存在典型的三倍体胚乳并且不存在无融合生殖。没有观察到甲虫访问该花序。
在莫斯科州栽培的II组植物（取自滨海边疆区、雷米佐瓦和索科洛夫D32自然种群的材料），与任何其他石菖蒲可育植物完全隔离，于2023年产生的花序在任何花中均不发育任何种子在自由授粉时。两处栽培肥沃植物之间的距离为21公里。
7月下旬至2021年9月和2022年8月在石菖蒲自然种群（第一组：阿尔泰边疆区和布里亚特；第二组：滨海边疆区）中观察到的花后花序经常受到各种昆虫幼虫的损害。幼虫以植物组织为食，啃咬花序轴内的通道。管周围植物组织呈褐色坏死，管腔内充满碎片和昆虫排泄物（图12A）。这些通道只在那些已经开始果实发育的花序中发现。在乌斯季卡尔曼卡（阿尔泰边疆区）监测到的32个具有广泛果实发育的花序中，19个花序具有由幼虫产生的通道。除了运河之外，在花序中还发现了无法结出果实的被破坏的花群（图12A）。我们的材料提供了石菖蒲（I组和II组）花后花序中Sibirheluscorpulentus发育的证据。捕获了S.corpulentus的幼虫（图12B）。在阿尔泰边疆区和滨海边疆区采集的石菖蒲花序中发现了S.corpulentus的蛹（图12C、D）。S.corpulentus成虫（图12F，G）被发现于滨海边疆区三个不同地点的石菖蒲（II组）以及两个石菖蒲种群（I组）（一个在阿尔泰边疆区，另一个在阿尔泰边疆区）收集的花序中。布里亚特共和国（补充表S2D）。在一个例子中（滨海边疆区），发现了一只刚从蛹中出来的年轻未硬化成虫。这些成虫、幼虫和蛹在体形和大小上彼此匹配，因此，它们在这里被视为同种。这里解释为S.corpulentus的幼虫与Platamartus的幼虫（两者的幼虫）有很大不同。Funamoto&al.,2020b)描述了该物种的总体外观以及每个身体背脊上有两个横向硬化脊，向后逐渐减少。P.jakowlewi的幼虫似乎只有一排严重硬化的行，这也可能是每个身体tergite的横向色素条纹上的脊（Funamoto&al.,2020b：照片3）。幼小的西伯鲁斯甲虫最终通过被破坏的花朵区域离开花序。2022年，所有西伯利亚甲虫的花序都已消失，到8月18日，滨海边疆区兴卡湖地区的运河已空无一人。
图10 俄罗斯阿尔泰边疆区乌斯季卡尔曼卡(Ust'-Kalmanka)的石菖蒲(IA组，A.americanussubsp.triqueter)花序中的卡特雷蒂科甲虫(Kateretidaebeetes)。AC、E&G、雄性花期；D&F，雌花期；A&B，Platamatusjakowlewi；C-G，西伯利亚·多普伦特斯；A-D，甲虫个体；E-G，交配对—照片：N.A.Vislobokov，2021年6月20日至23日期间。
在阿尔泰边疆区和滨海边疆区的石菖蒲植物花序轴内的运河中，以及无法结出果实的被破坏的花群中发现了Elachipteracornuta（双翅目：Chloropidae）的幼虫（图12H，I）。虽然本研究中发现的Sibirhelus幼虫、蛹和成虫大约与受损花后花序的管一样宽（图12D-F），但E.cornuta的幼虫比管更窄（图12I））。在滨海边疆区的石菖蒲花序中发现了两只氯螟蛹。除了叶绿蝽幼虫外，在检查的花序中还捕获了其他两种双翅目物种的幼虫。最后，在滨海边疆区受损的石菖蒲花序内收集了鳞翅目幼虫。花后花序的所有昆虫记录均以补充形式提供。表S2D。显然，人们对在植物标本室中收集被幼虫严重破坏的石菖蒲花序存在偏见。尽管如此，我们在公共收藏中发现了一些受损的花序。最显着的例子是来自美国缅因州的Ogden&Steinmetz2473(MUHW026899)。该植物是北美二倍体的典型代表（参见关于该集合的讨论）。包膜中的一朵花序被纵向切割，并在轴上显示出通道，类似于亚洲西伯利亚幼虫产生的通道。此外，在标本的扫描图像中还可以看到与亚洲卡特雷蒂科幼虫有些相似的幼虫。
讨论
亚洲的二倍体和四倍体是两个伪隐种——欧亚大陆石菖蒲的传统广义概念是基于生物体不断变异的思想。在大量植物标本馆收藏的研究中观察到的形态特征（Engler，1879、1905；Bogner，2011；Boyce，2012）。本研究支持并发展了Röst(1979)的早期结论，即数量性状的明显连续变化来自于三倍体相对于二倍体和四倍体的中间形态。当不育三倍体被排除在外时，剩余的可育二倍体和四倍体形成两个实体，可以使用叶通气组织的解剖结构轻松区分。Röst（1979）使用常见花园实验中的植物进行操作。我们提出了一种新的度量来描述通气组织解剖结构（Ncell），并表明利用植物标本馆材料，叶子通气组织的特征可以很好地发挥作用。结合亚洲各地丰富的植物标本馆材料和种群水平的收藏，我们确保Ncell的变异范围在二倍体和四倍体之间不会重叠。因此，Ncell可以作为真正的分类学特征。除了通气组织之外，在大多数情况下，叶片横截面的形状可以区分二倍体和四倍体。此外，我们发现了区分二倍体和四倍体的全新定性（而不是定量）特征，即是否存在附着在种子珠孔附近的种皮内侧的长的、通常分叉的毛。最重要的是，我们第一次强调了二倍体和四倍体种质之间核（nrITS）和质体（psbA-trnH、trnL-F、ndhF、rbcL）标记的显着且稳定的差异。有了几条独立的证据，我们毫不怀疑二倍体（本研究的第一组）和四倍体（本研究的第二组）应该被解释为两个不同的生物物种。
我们的数据支持早期关于亚洲二倍体和四倍体地理分布的想法（Röst，1978），但是掌握了从植物标本馆藏品中推断出的数据，我们能够提供更加精细的分布图。重要的是，Röst（1978）仅研究了来自俄罗斯的一种二倍体和一种四倍体种质，没有来自蒙古和中国大陆的材料。我们发现二倍体和四倍体的分布范围存在巨大差异，这进一步支持了它们作为两个不同物种的解释。
如果不对植物标本馆标本进行破坏性取样或对活体植物进行解剖，就无法安全地区分二倍体和四倍体物种。在比克福德等人的术语中，它们可能被认为是神秘物种。(2007)，只要不通过显微镜研究就无法观察到有区别的形态特征。在其他一些植物类群中也发现了类似的情况，包括澳大利亚Hydatellaceae，其中果实微形态的定量特征被发现最有用（Sokoloff等，2019）。我们认为，强调稳定的非分子诊断特征的出现是有用的，即使是微形态特征。因此，我们更喜欢伪神秘物种这个术语（例如，Bateman，2022）。
图11 2021年6月观察到的俄罗斯阿尔泰边疆区Ust'-Kalmanka石菖蒲（IA组，A.americanussubsp.triqueter）花序访客的累积花粉量。两个轴显示了计算的花粉量同一组访客在雄性和雌性花期聚集。花粉负荷计算为雄性或雌性花期记录的访客数量与该花期每个访客的平均花粉粒数的乘积。例如，我们记录了Platamartus甲虫在雄花开花期对石菖蒲花序的19次访问。在19个实例中的13个实例中，我们能够捕获甲虫并推断出每只甲虫上的花粉粒数量。平均花粉粒数为1362个。在雄花期访问花序的扁甲虫的累积花粉量为19×1362=25,878。简而言之，横轴可以让我们计算出在雄性阶段访客获取了多少花粉，纵轴则与雌性阶段向花朵传递了多少花粉有关。主要数据：补充在表S2C。
图12 2021年7月至8月，被昆虫及其幼虫损害的石菖蒲花序和Sibirheluscorpulentus的生命周期阶段。A&H-I，材料来自滨海边疆区，靠近汉卡湖，位于Kamen-Rybolov和Ilyinka之间，靠近Troitskaya河;B-G，材料来自阿尔泰边疆区、乌斯季卡尔曼卡。A，整个花序纵向切割（II组，A.verus）。注意部分花序轴和一些被幼虫破坏的花/果实（深棕色区域）；B,S.corpulentus的成熟幼虫；C，在花序轴受损部分用S.corpulentus蛹纵向切割整个花序（IA组，A.americanussubsp.triqueter）；D，(C)的细节显示蛹；E，来自同一地点的另一个花序中的S.corpulentus的蛹；注意纵向切开的水果和种子；F,花序内发育的S.corpulentus幼成虫；注意甲虫所在的花序轴受损区域以及横向切割的果实和种子；G，切花序的细节，花朵受损，花序内发育出S.corpulentus的幼年成虫；H，受损花朵区域的角翅蛾幼虫；I，用Elachipteracornuta幼虫纵向切割的花序细节。A&F-I，新鲜材料；B–E，乙醇固定材料。—照片：N.A.Vislobokov（A、C–I）、A.S.Prosvirov（B）。
不育三倍体是二倍体和四倍体亲本之间的杂种，其质体基因组继承自二倍体亲本——我们的数据强烈支持这样的观点，即三倍体（第III组）的起源是二倍体（第I组）和四倍体（第II组）之间的杂交父母。叶解剖学（通气组织结构和叶片横截面形状）的定量数据表明，第三组介于第一组和第二组之间。三倍体的杂种性质从第III组所有检查样品中出现的两种核糖体类型中可以清楚地看出，一种与二倍体共有，另一种与四倍体种质共有。事实上，在来自亚洲、欧洲和北美的收集品中，两种不同核糖型的存在是稳定的，这一事实与三倍体完全不育及其完全无性繁殖的证据一致。显然，减数分裂*的缺失解释了杂交植物谱系中常见的ITS序列缺乏同质化的情况（Alvarez&Wendel，2003）。这里研究的所有携带两种核糖体型的种质（组III）始终具有与二倍体种质（组I）共有的质体单倍型。在被子植物中，质体基因组通常是从母本遗传的，但在某些群体中也记录了父本和双亲遗传(Hansen&al.,2007；Matsushima&al.,2008；Zhang&Sodmergen,2010）。进一步的比较基因组数据将允许通过二倍体母本和四倍体父本之间的一次相同的杂交事件来检验关于所有三倍体起源的假设。一旦第一组和第二组被认为是两个不同的物种，那么将第三组视为杂交起源的第三个物种就合乎逻辑了。我们避免将其视为非分类单元，因为在我们看来，这种状态应该保留给不稳定的杂种，特别是那些与亲本物种不完全分离的杂种。三倍体石菖蒲具有明确的分布范围，与两个亲本物种的分布范围明显不同。在欧洲，它在没有父母的情况下生长。根据目前的知识水平，三倍体似乎与二倍体和四倍体在进化上完全隔离，并且表现得像一个独特的物种，尽管它们完全是无性繁殖。
来自亚洲和北美的二倍体可以在亚种水平上进行识别——除了亚洲之外，二倍体在北美也很出名，目前被认为是美洲石菖蒲(Thompson,2000;Haines,2011;Mohlenbrock,2014;吉尔曼，2015；莱斯，2020）。符合当前美洲松鼠分类学概念的北美样本显示，通气组织解剖学指标位于亚洲二倍体的变异范围内。此处使用的种子形态或分子标记与亚洲二倍体没有差异。早期的研究强调了亚洲和北美的二倍体是否应被视为同一分类单元的问题（Thompson，1995，2000；Sokoloff等，2021b）。北美二倍体最重要的形态特征是，可以利用植物标本馆收藏中的叶脉图案将它们与三倍体区分开来（Thompson，1995，2000）。本研究使用更大的样本，支持我们之前的结论（Sokoloff&al.,2021b），即叶特征不允许分离组的所有样本I（二倍体）和III（三倍体）在亚洲。总而言之，这些发现表明北美和亚洲二倍体之间存在某些差异。事实上，在来自亚洲的标本中，主脉通常可以在叶片的两侧找到，而来自北美的样本中通常存在一些同样发达的脉。然而，这种差异还远远不足以将所有植物标本从两个大陆分开。我们认为观察到的变异模式符合亚种的分类学概念。我们建议，来自亚洲（IA）和北美（IB）的第一组样本应被视为同一生物物种的两个亚种。我们知道，这种种下分化通常用变种而不是亚种来描述，特别是在北美分类学文献中。然而，对于地理上明确的实体使用亚种等级是有原因的（Sokoloff&al.,2021a）。
除了在植物标本馆收藏中观察到的叶脉模式外，叶片横截面的形状为将亚洲和美洲二倍体识别为两个亚种提供了重要论据（图6、7）。Kaplan(1970)首先强调了北美二倍体的特征，包括缺乏明显的叶片背面翼，他检查了来自爱荷华州种群的多达158个芽。通过我们具有良好代表性的地理采样，我们表明，根据横截面的形状，IA组和IB组形成两个明确但重叠的云。值得注意的是，只有IA的云与III组（三倍体）的云重叠。从图7的底行图可以看出，二倍体内的变异并不表现出连续的临床性质。这种变化不太可能用气候条件等因素来解释，因为我们从美洲和亚洲分布范围的不同部分采集了样本。我们相信，使用信息更丰富的DNA标记将揭示此处识别的美洲石菖蒲两个亚种之间某种程度的系统发育分裂。
菖蒲类群的物种和亚种的命名——菖蒲L.(Linnaeus,1753)的模式材料来自欧洲。所有证据都表明欧洲仅存在不育三倍体。因此，A.calamus这个名称在命名上比该属中的任何其他物种名称都具有优先权，应保留给三倍体（第III组）。
正如我们之前详细的命名研究（Sokoloff&al.,2023c）所示，Acorusverus(L.)Burm.f这个名称。适合命名四倍体物种（第Ⅱ组）。
命名二倍体物种（第一组）更成问题。Löve&Löve(1957)、Packer&Ringius(1984)和Thompson(1995)提议使用Acorusamericanus(Raf.)Raf这一名称。对于北美可育二倍体标本。对这个名称以及C.S.Rafinesque（1783-1840）提出的许多其他名称的解释并不简单。他总共提出了来自北美的四种石菖蒲新种：A.flexuosusRaf。（Rafinesque，1833），A.floridanusRaf。（Rafinesque，1836），A.americanus(Raf.)Raf。（Rafinesque，1836），基于菖蒲变种。美洲努斯拉夫。（Rafinesque，1828）和A.angustatusRaf。（拉芬斯克，1840）。作者研究过的任何植物标本都没有可用于这些名称。Rafinesque（1828、1833、1836、1840）提供的形态学描述非常简短，不包含可在现代分类学背景下使用的信息。在没有任何植物标本的情况下，菖蒲原始材料的唯一现存元素。americanus是Rafinesque(1828)提供的绘图。Thompson(1995)选择该图形作为菖蒲变种的选型。americanus并提出了来自缅因州的表型（Ogden&Steinmetz2473atCM），以适应二倍体植物名称的使用。然而，汤普森对选型及其支持表型的指定不能被认为是有效的，因为它是在博士期间做出的。没有ISBN或ISSN或印刷商声明的论文，而不是发表在书籍或期刊论文中。更重要的是，Rafinesque（1828）的绘图显示叶子具有明显的中脉，这是北美三倍体与二倍体的区别特征。此外，Rafinesque(1828:26)指出菖蒲变种。americanus有“椭圆形的蒴果[e]，有许多微小、细长的种子”。我们完全同意Thompson(1995)的观点，即北美可育植物的种子既不微小也不细长。在我们看来，Rafinesque实际上研究了不育三倍体植物，这些植物产生具有未受精胚珠的单性结实果实（Sokoloff和Sennikov，2023）。此类果实可以与可育二倍体的含种子果实一样长，但其特征是顶端是尖的而不是钝的，并且具有许多小的未受精胚珠（参见Sokoloff等人，2021b中的图8C、D）。Rafinesque(1828,1836)提到“蒴果”是尖锐的，因此与三倍体植物果实的形状一致，而他的“许多微小的种子”显然对应于许多未受精的胚珠。可育二倍体的果实通常是钝的（Sokoloff&al.,2021b中的图8A,B）。这些水果拥有一些大种子（大约与整个水果一样长），因为许多胚珠仍未受精。最后，Rafinesque很可能没有在二倍体的分布区域收集石菖蒲(Sokoloff&Sennikov,2023)。
Löve&Löve(1957)将其解释为二倍体植物后，所有北美植物学家对美洲石菖蒲(Acorusamericanus)这一名称的使用都是一致的。因此，为了植物命名的稳定性，我们提出保留A.americanus、A.calamusvar.的基名。americanus，具有保守类型，以修复其当前在二倍体分类群中的应用（Sokoloff&Sennikov，2023）。我们提出了Ogden&Steinmetz2473(CM313477)，菖蒲变种的无效指定表型。americanus作为其保守类型，保留现有的命名现状。
在目前的工作中，我们提出了一个新的命名组合，Acorusamericanussubsp。三角梳。11月，命名亚洲二倍体亚种。它的基名是A.triqueterTurcz。exSchott是迄今为止唯一的物种名称基于来自亚洲的二倍体材料。A.triqueter选型的鉴定很简单（Sokoloff&al.,2023b）。
石菖蒲属物种的地理范围是由气候和历史因素造成的——本研究首次详细说明了亚洲温带石菖蒲属物种的分布模式。尽管可以通过更密集的植物材料采样来实现进一步的细化，但我们可以得出结论，菖蒲属物种的分布范围在欧亚大陆仅部分重叠。美洲石菖蒲亚种triqueter是在东西伯利亚和蒙古发现的唯一分类单元。菖蒲是欧洲和高加索地区发现的唯一物种。这两个物种的活动范围在西西伯利亚南部重叠（图9D）。欧亚大陆二倍体和三倍体之间明显的经向分离与北美的纬度分离明显不同（图9A）。这可以部分解释为两大洲气候区域分布的差异。值得注意的是，在北美和亚洲，二倍体和三倍体的范围在气候条件相似的地区重叠（根据Köppen-Geiger气候分类的Dfb，Kottek等人，2006年；Beck等人，2018年）。在亚洲和北美，A.americanuss.l.是唯一出现在Dfc气候中的物种。温度状况似乎对于确定此处识别的所有三个物种的北部范围很重要。Fennoscandia和俄罗斯西北部欧洲地区菖蒲的北界类似于Kottek等人所显示的温暖夏季和凉爽夏季气候之间的边界（2006）。
石菖蒲不会出现在夏季气候凉爽的地区。阿尔泰边疆区的三倍体和俄罗斯远东地区的四倍体的范围限制大致与温度参数的相同限制一致，例如0°以上的有效热总和（度日）和五月的年平均最低气温（参见Afonin等人，2008）。后一个信号与石菖蒲植物启动下一代叶子早期生长的能力有关，这种能力在三倍体和四倍体植物中都发生在五月（Vinogradova，2004）。
美洲石菖蒲生长的气候比其他两个物种凉爽得多，但其分布范围并未延伸到有效热和（度日）高于0°且未达到1500的地区（参见Afonin等人，2008年）。这些观察结果支持了这样的假设：水生植物生长在水源已经得到保证的地方，这使得温度状况成为最重要的因素。Bobrov等人也获得了类似的结果。（2022）欧亚大陆北部的狸藻属（Lentibulariaceae）。
气候因素显然无法解释石菖蒲属物种现存分布范围的所有特征。最重要的是，A.americanus在西伯利亚和北美发现的Dfc和Dfb气候类型在北欧、东欧和乌拉尔地区广泛存在（Kottek&al.,2006；Beck&al.,2018），但A.a.欧洲和乌拉尔地区不存在americanus。种子化石的记录证明，肥沃的石菖蒲在第四纪冰川作用之前就已存在于欧洲（Dorofeev，1973；Gümbel&Mai，2004）。此外，在斯匹茨卑尔根岛（斯瓦尔巴群岛）始新世晚期发现了与菖蒲群现存成员类似的化石（Budantsev&Golovneva，2009）。根据已发表的插图，来自斯匹次卑尔根岛的化石可能是肥沃的。目前欧洲没有任何肥沃的石菖蒲只能用第四纪冰川时期的灭绝来解释（见Bogner，2011）。
历史数据表明，单次人类将三倍体引入欧洲，随后又引入美洲（Mücke，1908；Wein，1939；Thompson，1995）。除非发生表观遗传修饰或体细胞突变，否则两个大陆上的强制性克隆三倍体应该是相同的。Thompson(1995)进行了同工酶分析并得出结论，在所有15个检查的菖蒲s.str群体中似乎都存在单一基因型。来自印第安纳州、爱荷华州、北卡罗来纳州、俄亥俄州、宾夕法尼亚州和弗吉尼亚州。这使得菖蒲对于气候生态位模型具有吸引力，以确定美国是否发生了生态位变化。北美菖蒲分布区的很大一部分属于炎热的夏季Cfa气候，这在欧洲是罕见的（Kottek等，2006；Beck等，2018）。
二倍体和四倍体与授粉昆虫的相互作用——我们对美洲石菖蒲亚种授粉生物学的观察。阿尔泰边疆区的triqueter与Funamoto等人的作品非常相似。(2020a,b)在日本东京附近的越谷市制造。船本等人的工作。(2020a,b)几乎肯定是在A.verus上进行的，因为A.americanus在日本是未知的。我们的数据表明，石菖蒲与授粉甲虫Platamartusjakowlewi和Sibirheluscorpulentus(Kateretidae)的相互作用在二倍体和四倍体物种（A.americanus和A.verus）之间是保守的，并且在日本和西西伯利亚之间的距离超过4700公里。来自俄罗斯亚洲其他地区（布里亚特、滨海边疆区）的观察进一步支持了卡特里特物种和石菖蒲植物在大片领土上必须相互适应的假设。在发现P.jakowlewi和S.corpulentus与石菖蒲的相互作用之前，人们对它们的生物学和生命周期知之甚少。越来越多的证据表明，它们的大部分生命阶段都与石菖蒲有关，尽管它们的成虫会留下花序进行冬季滞育和传播。本研究扩展了对这些甲虫物种地理分布的了解，这两种甲虫物种以前在阿尔泰边疆区都是未知的。P.jakowlewi（图瓦共和国，雅库特，伊尔库茨克州，克拉斯诺亚尔斯克边疆区，日本）和S.corpulentus（伊尔库茨克州，滨海边疆区，日本）的所有早期记录（Kirejtshuk，1992；Funamoto等，2020a）均下降在已知A.verus和/或A.americanus结籽的亚洲地理区域内。目前有关石菖蒲分布模式的数据使得我们可以在目前未知的其他地区发现P.jakowlewi和/或S.corpulentus的记录。我们在A.americanussubsp.收藏品中发现了特征性受损的花序轴和干燥的幼虫。来自缅因州（美国）的美洲菖蒲提出了关于北美石菖蒲生物相互作用的问题。
花后花序中非授粉昆虫的幼虫——被卡特雷蒂科甲虫及其幼虫破坏的菖蒲花后花序可以进一步被其他昆虫侵染。显然，应该对这个问题进行更多观察。我们发现Elachipteracornuta（双翅目：Chloropidae）幼虫的特征是比它们出现的受损花序轴的通道更窄。E.cornuta的幼虫是植物腐烂部分的腐食体，但它们本身无法侵染植物，通常会跟随其他噬菌体啃食植物组织。我们对鳞翅目幼虫的记录也值得关注。与其他植食性昆虫类群一样，石菖蒲的文献中只记录了很少的鳞翅目昆虫。特别是，Lepidotarphiusperornatella(Glyphipterigidae)被认为与西欧、东亚和北美东部的美洲石菖蒲(Acorusamericanus)和菖蒲(A.calamus)有关联(Arita&Heppner,1992;Austin&al.,2017)，尽管该物种几乎不可能从石菖蒲花序。
石菖蒲属物种的自交亲和性以及关于植物与传粉媒介相互作用出现的假设——我们的直接观察清楚地表明，至少亚洲石菖蒲属植物是自交亲和的，并且可以在没有传粉媒介的情况下通过同卵受精或自花受精结籽。间接数据表明，自花授粉或同性受精在北美也可能很常见。Thompson(1995)揭示了二倍体A.americanussubsp.美洲菖蒲在同工酶变异方面接近强制性克隆三倍体菖蒲。明显引入的美洲美洲亚种植物。来自科罗拉多州丹佛市的americanus生长距离内布拉斯加州最近的分类单元超过500公里，但仍然结出丰富的果实(https://www.inaturalist.org/observations/89856553)。
石菖蒲是自交不亲和的，并且/或在没有卡特雷蒂科甲虫的情况下不能结籽。从滨海边疆区移植并在莫斯科附近种植的A.verus分离个体的花后花序中没有任何种子（本研究）支持了这一点。Vinogradova(2004)从莫斯科哈巴罗夫斯克边疆区培养了A.verus种质（凭证：Bochkin&al.64,MHA0293809，在此研究）。该克隆已产生许多花序，但尚未结籽。.Funamoto等人。(2020a)在日本观察到A.verus的孤立花序没有结籽。
我们假设石菖蒲植物和甲虫之间的相互作用首先是通过二倍体物种美洲石菖蒲建立的。卡特里蒂科甲虫的授粉提供了*的优势，但这些甲虫的潜在缺失并不限制坐果。很可能，随着明显较年轻的四倍体物种A.verus的自交不亲和起源，甲虫Platamartusjakowlewi和Sibirheluscorpulentus可能成为其有性繁殖所必需的。至少S.corpulentus以及可能的P.jakowlewi提供了与石菖蒲花序相关的高水平适应的例子，包括对石菖蒲植物组织中存在的甲虫有效驱虫剂的某些保护（ElNahal&al.,1989）；陈等人，2015；舒克拉等人，2016；这方面可能在上述kateretids向石菖蒲(Acorus)的授粉专门化中发挥作用。这些卡特里亚科动物从前成虫阶段到在植物类群中发育的转变可以被解释为它们生活方式的一个相当古老的特征，与其他已知生物学的卡特里特亚科动物非常不同。植物营养器官薄壁组织内的幼虫发育（根据Kirejtshuk，1989年和Kirejtshuk等人，2023年的说法，以高等植物为食的发育过程中定期营养变化的第四阶段）也支持了关于幼虫关联的显着年龄的假设。两个被认为是kateretid属和Acorus种。此外，应该指出的是，Platamatus属和Sibirhelus属彼此相当不同（显然不仅在成虫中如此，而且在幼虫中也如此：见上文），并且几乎不能被视为非常密切的相关性，因此，他们与阿科鲁斯的成员似乎是独立出现的。西伯利亚斯仅以一种最近的物种为代表。除了P.jakowlewi之外，Platamatus还从滨海边疆区描述了另一种物种(P.solskyi)(Kirejtshuk,1992)。来自蒙古和中国东北部的一些具有形态特征的Platamartus标本需要进一步的分类学研究。考虑到所有这些情况以及化石记录中卡特雷蒂科(Kateretidae)的早期出现（白垩纪早期：Kirejtshuk&Azar，2008），可以推定承认它们与石菖蒲(Acorus)之间存在相当古老的联系。
至于其他可能的石菖蒲昆虫传粉媒介，Bogner(2011)在来自广东（中国）的A.gramineus上记录了一种来自Contarinia(Cecidomyiidae)的蝇种，由R.Gagné命名，并附有一张带有粘性花粉的标本的图片。在它的腹部。根据与Z.A.的个人交流Fedotova，它与多食性物种C.maculipennis非常相似（Uechi&al.,2011）。该属物种相当丰富，属于瓮亚科，该亚科包括出现在化石记录中不早于中新世早期的所有少数植食性化石成员（Knor&al.,2013）。该属在近代动物群中描述了300多个物种，但没有化石。因此，目前没有理由假设这个双翅目家族中存在专门的传粉媒介。阿特莫维迪等人。（2018）记录了印度尼西亚某些无刺蜜蜂（蜜蜂科、蜜蜂亚科）对禾本科蜜蜂的有效授粉。在特殊的生态环境中，这些昆虫可能被认为是良好的传粉媒介，但它们并没有表现出与石菖蒲花序的特殊联系。
上述情景暗示了美洲石菖蒲具有自交亲和的祖先性质。在另一种可能的情况下，美洲菖蒲与菖蒲的二倍体祖先分离后，其自交不亲和性消失了。我们相信，这两种情况可以使用最近发表的菖蒲二倍体和四倍体成员的核基因组进行测试（Shi&等，2022；Guo等，2023；Ma等，2023）。
石菖蒲原产于温带东亚——人们通常认为三倍体（Acoruscalamuss.str.）首先出现在印度的喜马拉雅地区，然后被由人类传播到其他地区，包括欧洲和北美(Evstatieva&al.,1996;Li&al.,2010;Bogner,2011)。这一观点得到了石菖蒲在印度医学和文化中的重要性以及印度次大陆不同倍性水平植物的支持（Röst，1978；Ogra等，2009；Ahlawat等，2010；米塔尔等人，2015）。来自欧洲和地中海地区的人们显然是从印度首先了解到菖蒲的。应分析更多来自南亚的数据，以检验三倍体石菖蒲起源于印度的假设。我们的研究支持了Röst(1979)提出的替代假说，Röst提出了三倍体起源于温带东亚。当时尚未对中国温带石菖蒲的细胞型多样性进行研究，但Röst(1979)假设在那里可以发现二倍体。在本研究中，我们揭示了东亚阿穆尔河流域的一个区域，其中两种可育物种（A.americanus、A.verus）的分布范围重叠，并且这两个物种都显示出有性繁殖。可以合乎逻辑地假设三倍体杂种首先出现在该地区。由于石菖蒲属物种对温度条件敏感，因此应考虑杂交发生在气候稍凉的时期，此时美洲石菖蒲亚种的可能性。triqueter在中国东北地区的分布范围较广。石菖蒲在中国文化和医学中的重要性不亚于在印度（Shu&al.,2018）。一旦石菖蒲在北美原住民中具有强大的民族植物学用途（Motley，1994；Thompson，1995），显然它自古以来也被东北亚人民使用。由于对菖蒲属有如此浓厚的兴趣，三倍体植物被人们注意到并传播也就不足为奇了（Röst，1979）。四倍体（A.verus）和三倍体（A.calamus）植物很可能都是通过人类活动引入热带地区，包括印度次大陆和马来西亚（另见Röst，1979；Thompson，1995）。这与任何热带四倍体种质中缺乏结籽的情况相一致，这可能是由于缺乏专门的传粉者（参见Funamoto等人，2020a）和/或引入植物的克隆性质和四倍体的自交不亲和性造成的。
我们的数据表明菖蒲群的主要多样性中心位于亚洲温带而不是热带。我们质疑关于该群体热带起源的早期观点（例如，Mücke，1908）。例如，Baranov（1960：22）得出的结论是“在气候寒冷的国家，特别是东亚，菖蒲种子的不育是偶然的，并且完全取决于不利的温度条件”。事实上，几乎所有来自亚洲温带和凉爽气候地区的花后花序美洲猕猴桃和维鲁斯猕猴桃都长出了许多带有正常种子的果实。在热带地区，菖蒲组（即菖蒲）的可育植物不结种子。在印度热带低地栽培的A.verus种质通常不会产生任何花序(RheedetotDraakestein,1692；Röst,1978 Sokoloff&al.,2023c)。它们也是常绿的，与A.americanus和A.verus的温带种质中发现的冬季休眠状态形成鲜明对比（Röst，1978；Sokoloff等，2023c）。热带低地品种的生长模式可能是在A.verus的驯化过程中进化的。最近出版的A.verus完整基因组（Ma&al.,2023）为寻找生长模式中强烈种内变异的遗传背景以及明显的自交不亲和性提供了工具。
分类处理
美洲石菖蒲(Raf.)Raf.，新佛罗里达州1:57.1836≡A.calamusvar.美洲狼Raf.，医学博士。佛罗里达州。1:25.1828，nom.cons.prop.–类型（typ.cons.prop.作者：Sokoloff&Sennikov，Taxon72(6):1366.2023）：[美国]，缅因州，PenobscotCo.，Orono，BasinFrogPond，1942年7月13日，Ogden&Steinmetz2473[PlantaeExsiccataeGrayanae1216p.p.]（CM条形码0005[编号313477][不包括信封中的成熟水果]；同种型[所有不包括信封中的成熟水果]：CLEMS条形码CLEMS0075920[编号02071]、F条形码V0462365F[编号1595485]、FLAS编号72248、GH条形码01010595、IND条形码IND-0008301[编号97395]、LE条形码LE01249870！、MICH条码1207514、MUHW条码MUHW026899、NO条码NO0038632、P条码P02087753、US条码03816883[编号1925737]、WIS条码v0397276WIS）。笔记。–成熟的果实被排除在类型收集之外，因为它们是在另一个日期（1942年9月15日）收集的。
美洲石菖蒲亚种美洲分布。–加拿大（除育空地区和努勒维特地区外的所有省份和地区）、美国（阿拉斯加州、科罗拉多州[最近引入]、康涅狄格州、哥伦比亚特区、爱达荷州、伊利诺伊州、印第安纳州、爱荷华州、缅因州、马萨诸塞州、密歇根州、明尼苏达州、蒙大拿州、内布拉斯加州，新罕布什尔州、新泽西州、纽约州、北达科他州、俄亥俄州、宾夕法尼亚州、罗德岛州、南达科他州、佛蒙特州、弗吉尼亚州、华盛顿州、威斯康星州）。
美洲石菖蒲亚种(Turkz.exSchott)D.D.Sokoloff,M.V.Remizowa&Sennikov，comb.nov.≡A.trickTurkz.exSchott，Prod.Syst.Aroid.:578.1860–Lectotype(由Sokoloff&Sennikov在Diversity(Basel)15-766:3.2023中指定):[俄罗斯，布里亚特共和国，c.51,741°N，102,532°E]，达胡里亚，第十，1830年，[N.S.]Turczaninows.n.（LE条形码LE01082852；等选型：LE01082856、LE01082857、LE01082866、LE01082870）。–“石菖蒲变种。angustus”BesserinFlora17（Beibl）：30.1834，nom.nud.
分布——中国（内蒙古）、蒙古（多尔诺德、色楞格）、俄罗斯（阿尔泰边疆区、阿穆尔州、布里亚特、伊尔库茨克州、堪察加边疆区、克麦罗沃州、哈巴罗斯克边疆区、哈卡斯边疆区、克拉斯诺亚尔斯克边疆区、新西伯利亚州、鄂木斯克州、滨海边疆区、托木斯克州、图瓦、雅库特、后贝加尔边疆区）。
注解——标签错误地表明通卡位于达胡里亚。历史上的达胡里亚（或达乌里亚）位于贝加尔湖（后贝加尔湖）以东地区，通卡村就位于该地区。贝加尔湖以西80公里。
石菖蒲(L.)Burm.f.,佛罗里达州籼稻:84.1768≡A.calamusvar.维鲁斯L.，Sp。PL。1:324.1753–Lectotype（由Nicolson&al.指定，Interpret.VanRheede'sHort.Malab.:274.1988）：[图标]“Vaembu”inRheede,Hort.马拉布。11：t。1692年48月–表型（由Sokoloff等人在Diversity(Basel)15-785:4.2023中指定）：印度，马哈拉施特拉邦，科尔哈布尔市，Shivaji大学，Lead植物园，植物学系，2019年8月28日，D.D.索科洛夫等人。I-17（MW条形码MW0758480！）。=奥斯特(Oesterr)的石菖蒲(AcorusgriffithiiSchott)。机器人。Z.8:351.1858–正模标本：[不丹，扎什冈镇，c.27,339°N，91,547°E，“Bench”，1838年2月1-4日，W.Griffith519（Herb。东印度公司）]2626（K条形码K000883788；同种型：BM条形码BM000958483，K条码K000883697p.p、LE条码LE01082877、P条码P02137244）。=Oesterr的AcorusnilaghirensisSchott。机器人。Z.9:101.1859–Lectotype（由Sokoloff&Sennikov在Diversity(Basel)15-766:16.2023中指定）：[印度、泰米尔纳德邦、昆达河、尼尔吉里山，c.北纬11,284°，东经76,643°]，“孔达斯。在montibusNilagiri”，1851年4月，F.Metzs.n.[Hohenacker，东方印度植物V(M.Nilagiri)：1314]（LE条形码LE01082855！；同型：LE条形码LE01082858！）。=奥斯特(Oesterr)的石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)。机器人。Z.9:101.1859–正模标本：[中国。北京，昌平区]，唐山[小汤山]温泉附近的一条小河里，[1840年代，A.A.Tatarinovs.n.]（LE条形码LE01182329！；同种型：LE条形码LE01182325、LE01182326、LE01182327）。=AchoruscommutatusSchott，Prodr。系统。Aroid.:578.1860正模标本：[图标]“Acorus”，位于爱荷华州格里菲斯。PL。亚洲。3：PL。CLXII。1851–Epitype（由Sokoloff和Sennikov在Diversity(Basel)15-766:15.2023中指定）：[不丹，Tashigang镇，c.27,339°N，91,547°E，“Bench”，1838年2月1-4日，W.Griffith519（Herb。东印度公司）]2626（K条形码K000883788；同种表型：BM条形码BM000958483，K条码K000883697p.p.、LE条码01082877！、P条码P02137244）。=石菖蒲肖特在安。穆斯。机器人。Lugduno-Batavi1:284.1863≡A.calamusvar.斯皮里斯(Schott)英格兰在Candolle和Candolle，Monogr。潘。2:217.1879≡A.calamusvar.2:217.1879angustatusEngl.，Pflanzenr。四．23B（重量21）：312。1905年，名义。非法的。–正模标本：[日本，长崎]，Bürgers.n.（L条形码L0325912）。分配。–记录坐果的地区：中国（至少北京、黑龙江、河南、江苏、吉林、辽宁、陕西、上海）、日本、韩国、俄罗斯（阿穆尔州、犹太奥州、哈巴罗夫斯克边疆区、滨海边疆区、萨哈林州）.没有坐果记录的地区（以及引进植物）：不丹、中国（云南）、印度、印度尼西亚、泰国。该物种在斯里兰卡、孟加拉国、缅甸、老挝和越南的潜在出现和状况需要进一步研究。
石菖蒲L.，Sp.PL。1:324.1753≡A.odoratusLam.,佛罗里达州法国。3：299。1779，没有。非法的。≡A.elatusSalisb.,Prodr.搅拌。第一章阿勒顿：263。1796，名义。非法的。≡A.undulatusStokes，Bot。马特。医学。2：282。1812，名义。非法的。–Lectotype（由Suresh等人在Taxon32:130.1983中指定）：草本植物。林奈号447.1（林恩）。≡石菖蒲var.寻常型L.，Sp。PL。1:324.1753≡A.europaeusDumort.,佛罗里达州应用：162。1827–Lectotype（由Sokoloff和Sennikov指定）：Herb。林奈号447.1（林恩）。=曲菖蒲Raf。载于《AtlanticJ.》1：178。1833年–类型：未指定。=佛罗里达石菖蒲Raf.，新佛罗里达州1:57.1836–类型：未指定。=狭菖蒲Raf.，Autik。机器人。3：196。1840–类型：未指定。分配。–北美（加拿大、美国）；欧洲（大多数国家）；亚洲：阿富汗、亚美尼亚、阿塞拜疆、中国（至少黑龙江、吉林）、格鲁吉亚、印度、印度尼西亚、伊朗、日本、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、巴基斯坦、俄罗斯（西伯利亚西南部、高加索西北部）、土耳其、乌兹别克斯坦.显然也发生在其他一些国家，尤其是新几内亚。
鉴别要点
1.叶片边缘（背面和正面）叶片明显隆起。叶片（如植物标本中所见）具有几个均匀的平行维管束。种子珠孔侧有超过种子长度的毛。雄性花花期的肉穗花序宽度通常小于7毫米。常绿植物...................................A.gramineus群（本研究之外)
1.叶片边缘无明显肿胀。叶片（如植物标本中所见）具有几个均匀的平行维管束或具有一个明显的主维管束和几个平行的小维管束。种子珠孔侧无明显毛或有短于种子长度1/2的毛。雄花花期的肉穗花序通常宽7毫米以上。植物夏绿或常绿.............................................................2（菖蒲组）
2.植物不育：90%以上的花粉粒未用乳酚或乙酰胭脂红中的棉蓝染色。花后雌蕊没有发育或成熟的种子，只有未受精的胚珠，长度小于1毫米。在横截面中看到的叶层通气组织隔膜中的平均细胞数（未计算角细胞）范围为1.85至4.55(此处研究的95%样本为1.95-4.15)。三倍体................................................................A菖蒲s.str.
2.可育植株：50%以上（通常90%以上）的花粉粒被乳酚或乙酰胭脂红中的棉蓝染色。在北纬35°以上采集的样本中，花后花序通常具有成熟或发育中的种子，长度超过1.5毫米。二倍体或四倍体................................................................. 3
3.横截面中看到的叶层通气组织隔膜中的平均细胞数（未计算角细胞）范围为0.5至3.2（此处研究的95%样本为1.02–2.85）。种子珠孔侧有一簇长0.2-1毫米的毛；每颗种子中至少有一些毛发长度超过0.4毫米。至少有一些毛发在远端分叉。植物夏绿色或常绿。四倍体.....................................................................A.verus
3.在横截面中看到的叶板通气组织隔膜中的平均细胞数（未计算角细胞）范围为2.95至7.8（此处研究的95%样本中为3.40-7.15）。种子珠孔侧无毛或有毛均不分枝，短于0.15毫米。植物夏绿色。二倍体........................................................4(A.americanus)
4.叶片的背面和正面翼通常不存在（有时存在，但与叶层的界限较差）椎板的中心区域）。在植物标本中观察到的叶层通常在两侧具有几个同等发育的大维管束。当其中一束比其他束稍大时，该特征在样本的所有叶子中通常不稳定。北美洲...............................A.americanussubsp.americanus
4.至少椎板的近轴翼通常存在（很少不存在）。在大多数情况下，在植物标本室材料中观察到的叶层具有超过所有其他束的明显主束。亚洲...................................A.americanussubsp.Triqueter
结论
1.石菖蒲群的二倍体和四倍体成员应被视为两个不同的物种（分别为美洲菖蒲和菖蒲）。它们在质体和核标记、叶子解剖结构和种子微形态上有明显的差异。
2.石菖蒲s.str.是A.americanus和A.verus之间的不育三倍体杂交种。其质体基因组遗传自二倍体亲本。
3.石菖蒲显然首先在温带东亚进化，目前该地区十分罕见，并通过人类活动广泛传播。
4.这三个物种的分布范围各不相同。这些受到历史和气候（温度）因素的影响。
5.石菖蒲的原产地仅限于亚洲温带低地地区。美洲拟南芥的原产地包括亚洲和北美洲的温带和凉爽地区；旧世界和新世界品种形成两个亚种。
6.只有两种昆虫Platamartusjakowlewi和Sibirheluscorpulentus（Kateretidae）对石菖蒲花序的定期授粉在二倍体和四倍体物种之间是保守的，并且日本和西西伯利亚之间的距离超过4700公里。
7.美洲石菖蒲具有自交亲和性，在没有卡特里蒂科甲虫的情况下也能结籽。四倍体是自交不亲和的和/或在没有Platamartus和Sibirhelus的情况下不能结籽。来自热带亚洲和马来西亚的A.verus种质不结种子，并且与A.calamus一样，显然源自古代引入。
8.我们的数据为石菖蒲的药理用途及其进化基因组学和生态适应的进一步研究提供了新的框架。
9.气候生态位模型和常见花园实验将揭示同域物种之间的竞争在多大程度上影响北美、西西伯利亚和俄罗斯远东地区潜在的气候范围限制。
期刊：TAXON
文章标题：
Diploids and tetraploids of Acorus (Acoraceae) in temperate Asia are pseudocryptic species with clear differences in micromorphology, DNA sequences and distribution patterns, but shared pollination biology
作者信息：Dmitry D. Sokoloff *, Galina V. Degtjareva, Mikhail V. Skaptsov, Nikolay A. Vislobokov, Alexander G. Kirejtshuk, Alexander N. Sennikov, Elena E. Severova, Victor V. Chepinoga, Tahir H. Samigullin, Carmen M. Valiejo-Roman, Sergey V. Smirnov, Alexander I. Shmakov, Elena A. Marchuk, Margarita V. Remizowa
原文链接：https://doi.org/10.1002/tax.13173
文内图片及封面图片来源原文
