作者：潘静
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随着二代基因测序（NGS）在临床的广泛应用，越来越多的基因突变被检出，在获知患者所携带的基因突变后，如何评估预后为临床治疗选择做出指导？这些基因突变对CAR-T治疗的患者具有什么影响？潘静主任结合临床实践经验与对基础的探索，与大家分享TP53突变患者在CD19 CAR-T细胞治疗后的临床转归相关问题。
越来越多的基因突变被检出，但也带来了新的问题
基因测序技术发展非常迅速，从1977年的Sanger一代测序发展到2006年的Illumina二代测序平台，越来越多的基因突变被检测出来，临床应用也逐渐增加。随着二代测序深度不断加深以及检测Panel的不断扩大，对于白血病，特别是对于急性髓系白血病，都有非常显著的发展。2016年WHO分型标准，已经把一些基因突变包括GATA2，CEBPA等纳入，但是对于急性淋巴细胞白血病，基本上没有太多涉及基因突变的问题。
关于急性淋巴细胞白血病基因突变有来自国际BFM研究组发表在Journal of Clinical Oncology的两篇研究，分别为《Mutations and Delections of the TP53 Gen Predict Non response to Treatment and Poor Outcome in First Relapse of Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia 》和《TP53 Germline Variations Influence the Predisposition and Prognosis of B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Children》，这两项研究分析了一千多例儿童急性淋巴细胞白血病的样本，重点报道了TP53基因突变，发现TP53体细胞突变发生率为12%，这部分患者的预后非常非常差。
另一项是来自国内上海团队的研究（图一），从这项研究中我们发现突变检测的时候，其实不是仅仅只有TP53，包括FLT3，NRAS，KRAS等。同时我们也发现，治疗前的突变和治疗后的完全不一样，有些突变在治疗前是有的，但在复发之后是没有的，有些患者在复发之后出现新突变。
图一
大量新的基因突变检出，那么随之而来的问题就是，当我们拿到一份基因检测报告的时候，如何进行解读？如图二所示，如此一份信息量丰富的基因检测报告，对临床治疗的选择到底有多少帮助？所以我们发现临床面临的问题非常明确，就是随着基因测序的发展，越来越多的基因突变可以被检出，但是每一个病人的基因突变图谱完全不一样，包括突变频率、突变位点、甚至突变类型都不一样，而且很多患者存在联合突变，我们也不得不考虑联合突变的影响。患者的驱动基因在治疗过程中会动态改变，我们又该如何追踪？
图二
基因检测技术对传统治疗分层的冲击和对CAR-T治疗的分层作用到底有多大？这些都是需要思考和解决的，我们再回到CAR-T这个问题上，我们知道CD19 CAR-T治疗取得了高缓解率，多种巩固治疗包括序贯CD22 CAR-T治疗，桥接移植或是鸡尾酒CD19-22 CAR-T治疗提高了难治复发患者长期无病生存率，但复发仍然存在。而且每个病人复发的形式都不一样，有CD19阴性的复发，有CD22的部分表达，那么问题出在哪里？患者靠目前的CAR-T治疗可以达到非常高的缓解率，那后续的治疗该如何选择？一份复发患者的基因突变检测报告，能对后续的治疗选择带来帮助？能否进行分层治疗？
基因检测技术对传统治疗分层的冲击和对CAR-T治疗的分层作用到底有多大？
带着这些疑问，我们总结一期临床试验入组的68例患者，一探究竟。研究思路如图三所示。我们纳入32个相关的因素，包括MICM特征，CAR-T相关因素，后续治疗方式（序贯CD22 CAR-T或是桥接移植），339血液肿瘤突变基因，建立竞争风险模型，同时评估模型的稳定性，进行外部验证，去除统计学的影响，寻找与预后相关的因素。此外，我们对复发病人进行分析，选取6例具有临床标本的患者进行肿瘤细胞的分选工作，分别进行了临床复发病人的转录组测序（RNA seq）和全外显子组测序（WES），寻找复发的机制。
图三
探寻引起复发的预后相关因素---发现起决定作用的因素TP53突变
首先看一下68例患者的基因突变情况（图四左），我们发现基因突变类型非常的复杂，基本上每个患者都存在基因突变，甚至是多个突变，而突变的形式又是不一样的。进一步探究每个基因突变的影响作用，对每一个基因突变进行分析，发现在我们的患者中，TP53突变的发生率高达25%左右，也就是说1/4的患者来做CAR-T治疗的时候，就已经有TP53突变，说明这种高危的基因已经存在。考虑原因为目前CAR-T治疗并非一线治疗，而是作为复发难治患者的二线或三线治疗，相当于把更多的病人富集，所以TP53突变在这部分患者里发生率是非常高的。这也意味着临床医生需要重视这一问题。
从图四右我们发现携带TP53突变的患者复发率达60%以上，此外除TP53突变外还包括STAG2，STAG2也是急淋患者复发的一项高危因素。
图四
在分析了这部分患者基因突变的分布之后，进一步分析其对预后的影响。整体来说患者的效果是很好的，CD19 CAR-T治疗后桥接移植和序贯CD22 CAR-T治疗一年的无病生存是相当的（如图五）。
图五
回到我们的竞争风险模型，纳入32项相关因素之后的结果发现影响预后的主要因素有三个，分别为TP53突变、STAG2突变和基因突变的数量(图六）。那么引起复发的机制是什么呢？
图六
寻找复发的机制---关于TP53突变
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TP53突变多发生在DNA结合区域
标记所有患者TP53突变位点，如图七所示红色区域为P53DNA结合域，也就是TP53起着决定作用的一个蛋白结合位点，而如果一旦这个蛋白的结合位点发生突变，蛋白功能将受到严重影响。我们入组的患者，突变都在这个区域里，常见突变位点为R248Q/W，和文献报道相似，且发生率很高。我们的14个TP53患者中，有6个患者具有这种位点的突变，而且复发率也是非常高的。因此我们很关注这个基因，这个基因是非常常见的，大部分突变的形式是一个错义突变。
图七
TP53突变患者的预后如何呢？进一步分析我们发现，具有TP53突变的患者DFS明显低于没有TP53突变的患者(图八E），我们还发现一个有意思的事情，原则上我们认为患者肿瘤基因突变数目越多预后就会越差。而我们的数据发现，患者一旦携带TP53突变，不论携带其他多少突变，预后都是非常差的，TP53突变是决定性的因素（图八G）。此外，TP53突变患者临床和基因突变特征相似，联合突变预后也无明显差异，进一步支持了这一结论。
那么后续治疗的选择，由图八H呈现的结果我们可以看出，这部分患者无论是桥接移植还是序贯治疗，预后都是很差的，这提示我们TP53患者要改变治疗模式。
图八
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TP53突变是如何引起复发的？给临床治疗带来哪些启示？
CD19 CAR-T治疗后的复发形式主要有两种，一是CAR-T细胞丢失的复发，一是CD19抗原丢失的复发，那么TP53突变患者的复发究竟是引起了CD19抗原的丢失还是CAR-T效果不好导致的复发呢？
回顾既往研究我们发现一年内CAR-T细胞监控丢失，B细胞功能恢复的患者具有较高的复发率。球蛋白是反应B细胞功能恢复的一项指标，通过分析我们发现TP53突变并不影响球蛋白功能（图九），因此也就不会影响CAR-T的持续作用。
图九
进一步分析TP53突变患者的流式结果发现，所有患者的CD19都是下调的，通过相应的靶标分析发现仅仅就是B细胞，CD19几乎都是丢掉的。TP53突变的复发均出现CD19丢失，如图十所示。
图十
CD19丢失复发的机制，2015年发表在Cancer Discov的一项基础研究发现，外显子2丢失后会导致CD19表达的下调，甚至消失。2018年发表在 Nature medicine上的研究对CD19阴性复发做出了另一种解释，目前用的大部分的鼠源CD19 CAR-T几乎都是来自于FMC63这个抗体序列，而这个抗体序列结合位点就在胞外4号外显子的位置。通过分析发现，大部分CD19阴性复发的病人发生了4号外显子的丢失，导致CD19 CAR-T不能再次去接触它，因此发生复发（如图十一所示）。
另一种复发就是系别转化，从淋系转变为髓系，我们团队3例髓系转换病人，但只有1例是MLL重排，2例是TP53突变的，因此复发到底是不是直接跟MLL有关系？现在还没有定论，需要进一步探索。
图十一
在我们的研究中发现，不论是单CAR-T治疗，序贯CAR-T治疗或是桥接移植，绝大部分发生了抗原的丢失（图十二D所示，红色代表抗原丢失）。对于TP53突变的患者，肿瘤细胞在CAR-T细胞的压力下发生了克隆演变，出现CD19抗原的丢失（图十二E）。
另外，我们知道移植的患者如果不接受抗原特异性免疫治疗，很少发生靶点的丢失，那么CD19 CAR-T桥接移植后抗原丢失阴性复发来源于什么？应该来源于移植前CAR-T细胞压力下产生的癌细胞克隆演变。因此，如果要桥接移植，治疗时间是否应该提前或是增加其他的治疗以更好的清除掉发生克隆演变的癌细胞，降低复发率？这给现阶段的临床治疗选择带来了新启发与思考。
另外，我们分析CD19抗原丢失和没有丢失患者的复发时间，发现TP53突变的患者球蛋白在复发时并没有恢复，此时体内CAR-T细胞也是存在的。而一般复发的患者是先有球蛋白的恢复再出现复发（图十二F）。
图十二
CAR-T细胞依然存在，患者却复发了，该如何解释这种现象呢？如图十三所示，A为没有接受CAR-T治疗的患者，B为没有TP53突变接受CAR-T治疗后的患者，C和D为有TP53突变接受CAR-T治疗后的患者。圆形中的红色线代表患者的融合基因，由图我们可以清晰的发现TP53突变患者CAR-T治疗后与没有接受CAR-T治疗的患者相比融合基因显著增加，这也解释了为什么TP53突变患者肿瘤细胞克隆演变快，因为它可以导致染色体的不稳定性，使其获得新的突变，以至于在CAR-T压力下发生克隆演变，抗原丢失导致复发。
图十三
以上发现具有哪些临床指导意义呢？
接下来还需要进一步扩大样本量开展多中心研究验证TP53突变的临床意义，建立预后系统并寻找新的预后相关因素，同时通过基础实验验证TP53与CD19-的关系。但目前这些研究数据，也给临床工作带来了现实指导意义。首先是预后评估，评估治疗后的复发率。第二，指导分层治疗。
CD19抗原丢失率高的情况下，CD19 CAR-T后桥接移植之间，是否需要联合其他药物治疗以抑制CD19阴性肿瘤细胞的克隆演变以减少阴性复发？序贯CD22 CAR-T治疗也是一样，TP53突变患者不能再去走常规路，序贯治疗之后是否联合靶向药物？是不是考虑使用像奥拉帕利加BCL2抑制剂这样对TP53突变有间接效果的药物，来增加这部分患者的治疗成功率？相信基因突变检测指导下的分层治疗，会给难治复发患者带来新的治疗选择。
高博团队潘静主任、郑勤龙主任与中国医学科学院血液病医院实验血液学国家重点实验室冯晓明教授作为共同通讯作者，于2020年4月28日在Leukemia在线发表了这项题为《Frequent occurrence of CD19-negative relapse after CD19 CAR T and consolidation therapy in 14 TP53-mutated r/r B-ALL children》的研究。
