文|丙灿说
编辑|丙灿说
引言在感染过程中，细菌通过释放一系列分子信号，称为效应子，来操纵宿主的细胞过程，从而为其生存和繁殖提供有利条件，本文研究的目的是揭示细菌效应子对宿主细胞的作用机制，特别是在哪些生理过程中发挥重要作用。
研究表明，一些效应子能够进入宿主细胞内部并与宿主细胞的关键蛋白相互作用，从而干扰宿主细胞的正常功能，另一些效应子则通过细胞外信号传递途径，激活宿主细胞的反应，诱导宿主细胞释放有利于细菌生长的细胞因子。
在这项研究中，我们为了验证宿主免疫是否是叶状层中细菌发病机制中唯一需要颠覆的过程，对拟南芥进行了感染测定，使用了多个免疫途径严重缺陷的多突变体。
我们选取了三个主要模式识别受体基因fls2/efr/cerk1，这些基因发生突变的多突变体进行实验，另一个多突变体是bak1-5/bkk1-1/cerk1，该突变体在多个PRR下游的免疫信号传导中受损，第三个多突变体是DDE2/EIN2/PAD4/SID2，该突变体在所有三种主要的防御激素途径中都有缺陷。
我们使用了两种PstDC3000的非致病性突变衍生物：HRCC−突变体和DC3000D28E突变体，该突变体保持III型分泌系统完整，但删除了其中36个III型效应子中的28个，结果显示，DC3000D28E突变体在野生型Col-0中生长非常差，而且在多个免疫受损突变体中生长也非常差，这表明宿主免疫不太可能是感染过程中PstDC3000破坏的唯一因素。
在活跃的发病阶段，叶层细菌病原体如PstDC3000主要生活在充满空气的质外体中，而质外体则通过植物表皮孔称为气孔与外界直接相连，在病原体感染期间，质外体内的水分状态可能会受到空气湿度的影响。
在农田中，叶层细菌性疾病的暴发通常发生在降雨和高湿度之后1-3，18，这符合植物病理学中的“疾病三角”理论，叶层细菌性疾病最早和常见的症状之一是感染组织中出现“水浸泡”，尽管浸泡是否在细菌发病机制中起着积极作用尚不清楚，这些关键现象可以在实验室中得到证实。
我们进行了实验模拟高湿度和低湿度条件下，PstDC3000的生长情况，结果显示，PstDC3000在高湿度下成倍增加到非常高的水平，而在低湿度下则生长较差，这也反映在感染叶片的疾病严重程度上，高湿度条件下的感染更严重，而HRCC−突变体在所有湿度条件下都繁殖不良，说明其在湿度调控方面存在缺陷。
我们观察到PstDC3000的最具侵袭性感染通常在感染后一天内在高湿度下发生，在另一种宿主物种番茄中也观察到了类似的结果，实时成像显示，最初的水浸泡区域标记了后期疾病症状的发生区域。
有趣的是，水浸泡是一个短暂的过程，它在晚期疾病症状出现之前就消失了，使用标记有荧光素酶报告基因的PstDC3000菌株，我们发现浸水区和荧光素酶信号在叶片上检测不均匀，但它们广泛重叠，揭示了浸水区域是细菌在疾病晚期症状发作之前在叶层中积极繁殖的地方。
在进一步研究中，我们对PstDC3000的一个特殊突变体，即DC3000D28E，进行了更深入的调查，我们观察到DC3000D28E突变体在任何条件下都不会引起水浸泡，为了进一步确定引起水浸泡的效应子，我们将PstDC3000中的28个效应基因中的每一个单独转换回到DC3000D28E突变体中。
结果显示，大多数效应子并未导致水浸泡的发生，hopM1和avrE以及它们各自的III型分泌伴侣基因shcM和avrF，确实引起了水浸泡的发生，这个结果非常有趣，因为尽管HopM1和AvrE的序列并不相似，但之前的研究已经证明它们在毒力上具有功能冗余，并且在不同的丁香假单胞菌菌株和其他植物致病菌中高度保守。
我们还发现，通过转基因方法过度表达6xHis标签的HopM1或AvrE，并通过地塞沙松诱导启动子进行控制，在高湿度条件下也足以引起水浸泡的发生，相比之下，转基因表达AvrPto的D28E并未引起水浸泡。
细菌突变体的进一步分析证实，HopM1和AvrE是PstDC3000在感染过程中引起水浸泡的必需因素，双突变体avrE−/hopM1−无法引起水浸泡，即使将其接种量调整到与PstDC3000相似的水平。
相比之下，PstDC3000和单一突变体avrE−和hopM1−在高湿度下都能引起明显的水浸泡和后续的病理症状，并且在高湿度下积极繁殖，而双突变体avrE−/hopM1−无论湿度如何都不能繁殖。
我们发现，将HopM1和AvrE转基因表达到拟南芥中，可以恢复双突变体avrE−/hopM1−引起的水浸泡，在高湿度下也可以实现，这些结果表明，HopM1和AvrE的毒力功能可能是通过产生水质外体本身实现的。
因为细菌“更喜欢”在质外体的水环境中生存，而这种生存需要高湿度，因为叶质外体通过气孔直接与外界相连，通过向质外体提供短暂的补水，可以有效地恢复HopM1和AvrE的主要毒力功能，使双突变体avrE−/hopM1−接近PstDC3000的感染水平，并引发严重的病理症状，作为对照，PstDC3000、HRCC−突变体和CUCPB5452在短暂的补水下没有表现出这样的效应。
为了深入研究HopM1产生水性质外体的机制，我们着重关注了拟南芥中HopM1的宿主靶标，之前的研究表明，HopM1靶向宿主细胞中的反式高尔基体网络/早期内体，并介导几种宿主蛋白的蛋白酶体依赖性降解，包括MIN7。
它是一种TGN/EE定位的ADP核糖基化因子-鸟嘌呤核苷酸交换因子，参与囊泡运输，之前的研究表明min7突变植物在细菌繁殖方面存在一定增加，但是MIN7在病原体感染过程中的确切作用尚不清楚。
我们发现HopM1的毒力功能与其他免疫抑制效应物质的毒力功能完全不同，考虑到他们在这项研究中发现HopM1在产生水浸泡中的关键作用，他们猜测MIN7可能是调节质外体浸水的关键参与者，以响应细菌感染。
实验结果显示，min7突变植物允许在没有HopM1/AvrE的情况下发生质外体浸水，并允许avrE−/hopM1−突变体繁殖，MIN7的遗传去除足以模仿HopM1的毒力功能，部分导致质外体浸泡，min7突变植物在质膜蛋白的内吞循环方面存在缺陷，并且具有异常的PM，这表明HopM1降解MIN7可能损害宿主PM完整性，从而产生有利于感染的水性质外体。
如果质外体浸水是感染过程的关键步骤，我们假设植物可能已经进化出防御机制来对抗它，实验结果显示，PstDC3000触发的effector-triggeredimmunity完全阻断了质外体浸水，即使接种物PstDC3000的数量增加到与PstDC3000相似的水平。
相比之下，PstDC3000感染，水浸泡的叶子恢复到感染前的健康外观，表明在质外体浸水过程中宿主细胞死亡很少，PstDC3000触发的ETI稳定了MIN7蛋白，这些结果揭示了细菌毒力和宿主防御之间以前未被认识到的战斗，部分与MIN7稳定性有关，以控制质外体水的可用性。
通过研究免疫抑制和质外体浸水这两个关键致病过程，我们发现它们可能足以使叶层细菌感染成为可能，为了验证这一假设，我们使用了多种突变体植物进行感染实验。
实验结果表明，只有带有HopM1效应子的DC3000D28E，而不是DC3000D28E或DC3000D28E，引起强烈的水浸泡，积极繁殖，并在PTI受损的突变植物中产生明显的疾病症状，缺陷PTI和水性质外体诱导效应子的存在几乎可以将非致病性突变体转化为拟南芥叶层中的毒力病原体。
为了构建一个模拟免疫抑制和质外体浸水这两个过程的多宿主靶点突变体，我们对PTI突变体进行了MIN7基因的突变，通过使用CRISPR技术，我们生成了min7/fls2/efr/cerk1和min7/bak1-5/bkk1-1/cerk1四重突变体，这些四重突变植物表现出与野生型Col-0植物相似的形态，并在高湿度下显示出一些浸水斑点的趋势。
最令人兴奋的是，这些突变体允许非致病性HRCC−突变体在高湿度下积极繁殖，最终种群比Col-0植株高出约5倍，MBBC植株比MFEC植株更高，在这些四重突变植物中，hrcC−突变体引发了突出的疾病萎黄和坏死，而在Col-0植物，min7或PTI突变体中没有观察到这些症状，MIN7和PTI信号的双重破坏足以重建模型叶层细菌性疾病的基本特征。
非致病性HRCC−突变体在野生型叶层中的积极繁殖类似于存在于健康叶子质外层中的共生细菌群落，在野生型Col-0植物中只能检测到较低水平的内生叶层细菌群落，在植物从正常生长条件转移到高湿度条件时，MFEC和MBBC四重突变植物允许内源性内生细菌群落过度增殖，并表现出高湿度依赖性的特征。
这个结果很有趣，因为最近的一项研究表明，对真菌病原体的免疫受损会导致在植物中有益的根定植真菌过度生长，从而对拟南芥产生有害影响，这说明了一个潜在的共同主题，即宿主必须严格控制共生和有益微生物群的水平，以获得最佳植物健康。
未来的研究可能需要进行基于植物16SrRNA扩增子的综合分析，以确定Col-0、mfec和mbbc植物中共生细菌群落的组成是否也存在湿度依赖性变化。
研究结果表明，细菌效应子的作用不仅仅局限于单一生理过程，而是涉及到多个宿主细胞功能的颠覆和干扰，这些效应子作用的复杂性和多样性为细菌的发病提供了多个入口和机会，该结果对于深入理解细菌感染的病理机制，寻找新的治疗靶点和开发新型抗菌药物具有重要的学术和临床意义。
参考文献：拉德伯特，《豆类细菌性疾病》
马勒维尔，《植物病理学》
纳纳尔·比西尔，《被围困的植物细胞：植物免疫系统与病原体效应物》
