前言：
钙调节蛋白激酶是植物细胞内信号传导的关键成分，可介导应激诱导的对环境变化的快速反应，我们鉴定了拟南芥（拟南芥）ORESARA1（ORE1），衰老的发育主调节因子，作为直接的CPK1磷酸化底物。
CPK1在固有无序区域内的热点处磷酸化ORE1，这增强了ORE1对其下游靶基因双功能核酸酶1（BFN1）的转录激活，过度表达ORE1的植物，但不是缺乏CPK1磷酸化热点的ORE1变体，促进早期衰老，此外，ORE1是CPK1信号传导诱导的增强细胞死亡所必需的。
植物材料
拟南芥生态型Col-0野生型和衍生的转基因过表达和突变植株在20°C和60%相对湿度的生长室中生长，光周期为8小时（光强度150μmol/m）2s）在堆肥土壤中（42.42%[w/w]EinheitserdeP，42.42%[w/w]EinheitserdeT和15.15%[w/w]（Perligran[Kausek]）。
克隆CPK1全长，截短的CPK1-VK和用于乙醇诱导过表达的激酶缺陷变体，并按照补充方法中的说明选择品系。CPK1变体的过表达是通过在封闭的乙醇/水蒸气气氛（5.0%[v/v]乙醇和1.99%[v/v]水在液相中不与植物接触）中孵育9周龄植物来诱导的。
纯合cpk1-1（SALK_096452），cpk1-2（SALK_080155c）和矿石1-1（SALK_090154）突变体使用根据Salk研究所基因组分析实验室网站设计的引物通过PCR选择，引物也用于鉴定这些系的双纯合突变体。
对于发育衰老测定，35S亲：ORE1线和 35S亲：ORE1Δ17线与矿石1-1和Col-0一起生长在20°C和60%相对湿度的生长室中，光周期为16小时（光强度，240μmol/m）2s）6周。
DNA构建体和转基因拟南芥过表达系
DNA构建体和转基因系的产生在补充方法中有详细描述。简而言之，二进制构造pI4-cpk1亲-alcR-alcA亲-CPK1-VK-Strep和相应的 CPK1-VKD274A、CPK1和CPK1D274A编码不同形式的StrepII标记CPK1的变体用于转化拟南芥cpk1-1突变植物，用于乙醇诱导的表达系统。
35S亲：使用载体pGreen1的ORE0229-构建在Balazadeh中描述;相应的过表达系具有遗传野生型（Col-0）背景。转基因拟南芥系与35S亲：ORE1Δ17在载体中，pGreen0229在ORE1-1突变体背景中产生。
CPK1蛋白提取、亲和纯化和检测
对于蛋白质纯化，将0.5g叶材料在液氮中研磨并在1.5mL提取缓冲液EGTA;20mMDTT;0.5mM4-。在21°C下以000，4g 离心20分钟后，将1mL上清液与40μL链球菌肌动蛋白MacroPrep一起孵育，并在20°C下在旋转轮中孵育4分钟。
将链球菌-他汀基质以1g离心700分钟沉淀，弃去上清液。用1mL洗涤缓冲液洗涤具有结合蛋白的基质四次。纯化的StrepII标记的CPK1可用于与基质结合的体外激酶测定，或通过在SDS上样缓冲液中孵育基质0分钟洗脱，用于随后的凝胶电泳和免疫印迹。
使用链球菌素碱性磷酸酶或链球菌肌动蛋白辣根过氧化物酶偶联物（IBA）可视化链球菌II标记的CPK004蛋白。对于链球菌-肌动蛋白碱性磷酸酶偶联物，将硝酸纤维素膜在碱性磷酸酶缓冲液与163μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸二钠盐和327μg/mL硝基蓝氯化四唑鎓。
对于链球菌-肌动蛋白辣根过氧化物酶偶联物，将硝酸纤维素膜与SuperSignalWestFemtoECL底物（赛默飞世尔科技）孵育，并使用ImageStation440CF（柯达）检测发光。
拟南芥叶肉原生质体中的瞬时表达和活力测定
将叶条在6mL酶溶液中孵育3小时。加入相同体积的W5缓冲液并离心原生质体。将W5缓冲液中的细胞密度调节至2×105细胞/mL，细胞在冰上休息30分钟。每次转染使用11%（w/v）聚乙二醇溶液和总量为20μg或30μg质粒DNA的21，25个细胞。
将细胞在涂有6%（v/v）小牛血清白蛋白的5孔板中孵育，直到染色和计数（在活力测定的情况下）。用3μg/mL碘化丙啶和26μg/mL荧光素二乙酸酯转染后5h和5h对原生质体进行染色。
使用荧光显微镜（尼康Eclipse90i）在计数室中对死质体和活原生质体进行计数。逻辑回归被用作分析细胞死亡率差异的统计工具（补充数据集）。
用于MS和磷酸肽富集的蛋白质制备
对于每个生物重复（图2A）将五个拟南芥莲座结汇集并在液体N中研磨2，并用500.1mL提取缓冲液提取5mg该粉末。将该提取物中的250μg丙酮沉淀总蛋白溶解在50μL6M尿素/2M硫脲，pH8的混合物中。
加入碘乙酰胺至终浓度为2.5mM并在室温下孵育20分钟后，将样品用1.25μg内蛋白酶Lys-C（WAKO化学品）在室温下预消化2.5小时。样品用四体积Tris-HCl，pH8稀释，并在室温下用0.5μg/μg测序级修饰胰蛋白酶（Promega）消化16小时。
样品用2%（v/v）三氟乙酸（TFA）酸化以达到pH≤3。通过C18尖端进行脱盐（Rappsilber等人，2003）。为了富集磷酸肽，2.5毫克TiO2将磁珠（GL-Sciences）与200μL溶液C（300mg/mL乳酸;80%[v/v]乙腈;0.1%[v/v]TFA）平衡。
将浆液置于200μL移液器吸头中的自制微柱中，以EmporeC8盘（3M）为塞并离心（2000g，5分钟）。将脱盐肽样品与溶液C（1：1）混合并加载到TiO上2-柱。首先用200μL溶液C洗涤色谱柱，然后用200μL0.1%（v/v）TFA和5%（v/v）乙腈的混合物洗涤色谱柱。
磷酸肽从TiO中洗脱2珠子依次使用5%（v/v）氢氧化铵和5%（v/v）哌啶。洗脱液立即用44μL10%（v/v）TFA酸化，以达到pH<3。在质谱分析之前，富集的磷酸肽在C18吸头上脱盐。
质谱数据分析与统计
离子强度值用于定量数据分析。cRacker（Zauber和Schulze，2012）用于基于MaxQuant输出的磷酸肽离子强度的无标记数据分析（证据.txt）。所有磷酸肽和非磷酸肽均用于定量。
在每个样品中，将每种磷酸肽离子种类（每个m/z）的离子强度与该样品中所有非磷酸肽的总离子强度（磷酸肽离子强度/离子强度非磷酸肽的总和）归一化。
随后，将每个磷酸肽离子种类（即每个m/z值）与所有处理中该离子的平均归一化强度进行缩放。对于每种磷酸肽，在归一化和缩放后对来自三个生物学重复的离子强度值进行平均。
反式活化检测
BFN1 的∼0.1kb上游启动子区域（BFN1亲）通过拟南芥基因组DNA的PCR扩增并插入pENTR/D-TOPO载体（Invitrogen）。然后将序列验证的入口克隆转移到p2GWL7.0载体通过LR*承载萤火虫荧光素酶（FLuc）编码区以生成BFN1亲：FLuc 报告器向量。
用双荧光素酶报告检测系统（Promega）测定荧光素酶活性。效应器、报告器和对照（35S亲：RLuc或UBI亲：GUS）使用聚乙二醇将质粒共转染到由矿石1-1莲座状叶（播种后38天）制备的叶肉细胞原生质体中。
使用每种构建体的6μgDNA。将原生质体在室温下在黑暗中孵育14小时。使用GloMax20∕20发光计（Promega）和TriStarLB941多模式酶标仪（Berthold）记录发光。根据内部控制报告基因的活性计算归一化和相对启动子活性。
EMSA
纯化消费税-ORE1和消费税-ORE1Δ17使用上述抗GST抗体（1：10，000稀释度）通过免疫印迹检测蛋白质。EMSAs的执行如前所述。按照制造商的说明，使用奥德赛红外EMSA试剂盒（LI-COR）进行结合反应。
在6%（w/v）延迟凝胶（EC6365BOX，Invitrogen）中分离DNA-蛋白质复合物，并使用LI-COR的Odyssey红外成像系统检测DY682信号。
统计学
对于统计分析，我们测试样本组中重复值的正态分布。在所有多个样本组中重复值呈正态分布的情况下，使用Tukey事后检验进行单因素方差分析。当并非所有重复值都呈正态分布时，要么进行曼-惠特尼U检验或使用邓恩-邦费罗尼事后测试进行克鲁斯卡尔-瓦利斯测试。
对于仅包含两种可能状态的数据（即图3C、“原生质体在23h内死亡”和“原生质体存活这23h”）采用逻辑回归法分析两个共表达组细胞死亡率的差异。
统计检验的参数在补充数据集中给出。根据实验类型（生物化学、基因表达数据、植物生长测定）选择符合该领域标准的样品量，并在相应实验的每个图中说明。
诱导CPK1-VK的表达产生一种活性的钙非依赖性酶，从而触发细胞死亡
乙醇诱导型 CPK1 表达系，编码StrepII标记的全长CPK1、截短的CPK1-VK（氨基酸1至413）或激酶缺陷变体CPK1D274A和CPK1-VKD274A，在Cpk1-1（SALK_096452）敲除植物。基因表达由alcA控制亲，真菌alcA启动子。
在原始方案的修改中，相应的乙醇结合转录调节因子alcR的表达由CPK1驱动亲.在这里，与之前使用组成型花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子（35S）的研究相反。当植物暴露于乙醇蒸气时，CPK1变体在通常产生天然CPK1蛋白的细胞，组织和器官中合成。
通过RT-PCR分析的构建体的表达早在乙醇诱导后30分钟就观察到（补充图2）。1小时后，通过免疫印迹和标准碱性磷酸酶检测并在1小时后使用敏感的辣根过氧化物酶衍生的发光检测（补充图3）。在8小时。
差异体内磷酸化蛋白质组学鉴定转录因子ORE1的瞬时磷酸化
鉴定CPK1的体内底物，表达CPK1-VK和CPK1-VK的植物D274A暴露于乙醇蒸气中，并在处理前（0h）和处理后1h和2h收获叶片材料。对蛋白质提取物进行差异磷酸肽分析，并通过质谱法检测几种差异磷酸化的肽。
其中一种肽在CPK7-VK衍生样品，这种肽代表源自NAC转录因子39610/ANAC1。该肽包含204个氨基酸ORE224蛋白中的氨基酸285至1，并且位于NACDNA结合区的C末端。
结论：
植物的衰老是一个高度协调的过程，其进化过程是为了确保从垂死的器官（老化的叶子）中最大限度地恢复营养，以使新形成的器官（嫩叶，种子和果实）受益。
叶子衰老的能力由相互连接的转录网络控制，其中NAC转录因子ORE1通过激活已知在衰老中起关键作用的各种基因的表达来充当主调节因子。
