文丨初八没烦恼
编辑丨初八没烦恼
油棕是一种多年生热带木本油料作物，有‘世界油王’的美誉，在非洲、南美洲、东南亚广泛种植。
在我国云南、广西、福建、广东、海南有少量分布，棕榈油一直稳居第一大植物油，占全球植物油产量约36%，在食用油中占有重要比重。
在20世纪70年代到90年代，我国多次尝试油棕引种，但因不合理利用和植物病害流行因素，商业化种植停止。
致使现有分布油棕资源稀少，主要是片段化分布，由于长期的地理隔离和生态环境差异对自然资源的选择。
致使油棕资源存在丰富的遗传变异，为了对原始资源进行更好的保存利用，亟需探索油棕资源保护的最佳策略。
油棕资源保护的前提应该是充分掌握原始资源中基因组差异、形态差异、环境适应性，去除同质化、遗传距离较近的冗余单株以获得高效保存。
核心种质构建是保护遗传多样性和遗传结构的重要途径，可最大程度的保存原始种质的基因组信息。
在20世纪80年代阐明了核心种质构建的要求，认为核心种质构建可提高原始资源的保存效率和利用效率，相关研究也表明，核心种质的筛选可获得含有稀有等位基因的优异资源。
为开展重要性状的遗传规律研究奠定了基础，加快了全基因选择育种、分子育种、杂交育种等育种进程。
油棕果实性状、树体形状等外观形态上差异较小，难以通过表型鉴定的手段将其区别，但在遗传上又存在较多优良变异，此外油棕属于高大林木作物，致使鉴定周期较长。
且容易受环境因素的影响，随着分子标记技术的快速发展，基于PCR技术的SSR标记具有稳定强、准确快速、多态性较高。
可覆盖整个基因组等优点，迅速成为核心种质筛选的有效方法，被广泛应用苜蓿、龙眼、橡胶等作物的核心种质和指纹图谱构建。
针对现有圃存大量油棕资源来源混杂、遗传背景不清的现状，为提高资源的保存和利用效率，基于国内外已公布的SSR引物。
通过TP-M13-SSR方法筛选了高多态性引物，通过荧光毛细管电泳技术筛一批核心种质，并对核心种质进行鉴定，构建核心种质DNA指纹图谱。
以期为油棕种质资源的创新利用和新品种培育提供材料基础，也为减少将来种质的收集盲目性。
基于Nei1983遗传距离，采用软件构建NJ聚类分析图，结果605份种质资源在阈值为0.08时被分为3个亚群，其中亚群Ⅰ包含152份，亚群Ⅱ包含201份，亚群Ⅲ包含254份。
来自国内的种质和国外收集的种质出现不同程度的交叉聚类，每个亚群中都包含了国内种质和国外种质，其中来自东南亚地区和非洲地区的也存在交叉聚类。
没有严格按照地理分布聚类在一个亚群，来自同一地区的材料分布在三个类群，该结果表明我国早期引入的油棕种质来自东南亚和非洲。
且遗传背景较为复杂，这为SSR多态性引物的开发提供较多的变异位点，有助于育种材料选择的多样性。
将605份SSR油棕数据导入软件构建核心种质，基于等位基因最大化和遗传距离最大化抽取出200份核心种质。
利用软件进行核心种质、保留种质和原始种质的遗传参数计算，平均等位基因数、平均有效等位基因、香农信息指数、基因多样性的保留率。
分别占100%、120.06%、111.8%、106.0%，检验结果表明核心种质与原始种质的遗传多样性无显著差异。
利用软件对将逐步聚类位点优先法每次抽取的核心种质、保留种质和原始种质进行基因多样性评价，当基因多样性呈现出最大值时。
选择此次抽取的种质集合作为初级核心种质库，进一步对初级核心种质库进行遗传多样性分析，平均等位基因数。
平均有效等位基因、香农信息指数、基因多样性的保留率分别占95.5%、111.4%、106.8%、103.7%，T检验结果显示核心种质与原始种质的遗传多样性参数无显著差异。
核心种质遗传参数评价核心种质的确认核心种质群体遗传参数保留率越高，核心种质和保留种质分布越均匀，说明抽取结果越好。
M策略和多次聚类位点优先抽取核心种质的遗传参数显示，M策略的等位基因、基因多样性等遗传多样性参数保留率明显高于位点优先法。
另M策略法抽取的最佳核心组合种群规模较小，具有良好的代表性，并最大程度保持原始种质的遗传多样性和遗传结构。
将选取M策略法抽取的200份核心种质确定为605份种质的核心种质库，进行DNA指纹图谱的构建。
根据30个标记在原始种质中的区分鉴别能力，基于最小引物组合原则，优先使用鉴别能力较强的标记进行组合鉴别。
使用YW136、YW184、YW195、YW76引物组合能将200份核心种质完全区分，利用筛选出的30对核心SSR引物对200份核心种质进行扩增。
通过毛细管电泳检测技术对每份种质的扩增产物进行检测，得到每个位点在每个材料等位基因，以bp型的数据格式输出，部分毛细管电泳结果。
参考指纹图谱构建方法，优先选用鉴别能力较强的核心引物，利用等位基因数据建立200份油棕的指纹图谱，结果显示200份核心种质均能完全区分。
均具有唯一的指纹代码，将4对引物按下列顺序排列并赋值为YW136(A)、YW195(B)、YW184(C)、YW76(D)，使用各位点扩增的等位基因和位点带码形成各份种质的指纹带码。
对200份种质在30对核心引物的扩增的等位基因进行整理，SSR指纹图谱数据批量导入草料二维码生成软件中。
分别生成了200份油棕种质的分子指纹图谱二维码，为部分种质的指纹图谱二维码，扫描后可直接获取该种质的相关信息。
随着国内油棕分子育种逐渐成为研究热点，国内种质资源众多、遗传差异不清，无法对种质资源进行精准的选择创新和测序挖掘。
因此构建核心种质极其重要，在核心种质构建时取样策略是决定核心种质构建效果的重要前提，目前较多研究人员基于不同研究目的。
采用基于遗传距离和等位基因最大化两种原则构建核心种质，不同侧重方式和构建方法核心种质存在较大差异，其中M策略研究法是遗传多样性较高的方法。
已在油料作物和多种林木作物中广泛应用，该策略可保留所检测到的所有基因型，较好的保存了一些特异的稀有资源，适用于植物遗传性状解析的基础研究。
本研究选用M策略法构建了200份油棕核心种质，遗传参数的保留率均大于100%，经t检验表明核心种质与原始种质间遗传参数无显著差异。
且显示在主坐标分析图中均匀的分布于原始种质资源中，能够很好的代表原始种质的遗传多样性信息，提出的核心种质应保留原始种质70%以上等位变异类型。
且核心种质变异变幅在30%以内的构建要求，确定核心比例和遗传多样性信息含量是核心种质构建的关键。
前人研究表明，一个占所有种质资源的5%~10%的核心种质集合可以代表原始群体70%的遗传变异，但抽取样本比例是基于特定物种遗传结构和种质资源的数量。
也有研究学者认为核心种质的取样比例跟构建方法息息相关，无论采用怎样的构建方法，过高的抽取比例均导致抽取的冗余，过低的抽取比例造成遗传多样性降低。
M策略与各类抽取策略相比，是冗余度最低，也是遗传学家和分类学家最常使用的方法，M策略是基于保留最全等位基因数原则下进行核心组合构建，群体的抽取比例越大。
说明该群体等位变异越多，遗传多样性越丰富，核心群体利用潜力越大使用M策略对来自安哥拉和喀麦隆两国766份油棕种质。
在分组抽取和整体抽取法条件下分别抽取289份和91份核心种质，期望杂合度分别为0.720和0.750，期望杂合度和抽取比例低于本研究。
利用法从来自尼日利亚的186份原始种质中抽取到65份核心种质，抽取的核心种质期望杂合度低于本研究。
说明本实验抽样比例较合理，且核心种质群体中等位变异更丰富，本研究以33%抽取比例构建的核心种质成功保留100%的等位基因。
最大程度的保留了原始始种质最完整的遗传变异，有效性和实用性较强，既满足了种质保护的需要，又代表了原始种质的遗传多样性和遗传结构，为种质材料的选择创制提供了依据，提高了种质利用效率。
经过复筛之后，从220对引物中挑选出PIC大于0.650的30对核心引物进行605份样本的检测，对每对引物的进行荧光基团修饰合成。
引物合成、PCR体系、PCR反应程序以及毛细管电泳检测步骤与引物筛选阶段相同，利用软件对测序仪得到的原始数据进行分析，通过比较泳道内分子质量内标与样品峰值的位置。
得到片段大小，统计各样品等位基因位点，纯合位点记录为X，杂合位点记录为X/Y，杂合位点中的小片段数据在前，大片段数据在后，等位变异缺失位点记录为0，使用软件计算各个样品间的遗传距离，根据遗传距离构建进化树。
基于最大等位基因数和最大遗传距离原则，使用多次聚类位点优先法和M策略法进行核心种质的抽取，采用逐步聚类位点优先方法。
对UPGMA聚类的最低分类水平下的两份种质，依据稀有等位数目保留稀有等位基因较多的一份，在稀有等位基因数据相同的情况下。
依据等位基因数抽取等位基因数较高的一份，等位基因数相同的情况下，随机抽取一份，采用M策略法是按照软件算法基于最大等位基因原则一次性抽取。
对抽取种质使用软件对抽取的核心种质与原始种质遗传参数的变化和保留率进行评价确定，利用分析抽取核心种质的代表性，检验分析其核心种质与原始种质的差异显著性，构建橡胶品种的方法，利用30对核心引物的等位数据进行核心种质DNA指纹图谱的构建。
