大家好，今天推送的文章来自于2021年8月发表在Bioresource Technology上的“Highly thermostable and promiscuous β-1,3-xylanasen designed by optimized ancestral sequence reconstruction”，该研究的通讯作者是华侨大学的张光亚教授。
祖先序列重建（ASR）是一种新兴的半合理蛋白质工程设计策略，它可以识别整个蛋白质中稳定但中性的突变。ASR产生的酶表现出更高的稳定性、底物混杂度或两者兼有。另一方面，ASR有一个共同的缺陷，即无法保证推断出的序列在进化史上是正确的。一些推断出的祖先蛋白质在性能上比现有蛋白质差很多。原因之一可能是Blast搜索到了大量的推定序列，这可能会对祖先蛋白的推断产生不利影响，并“误导”中性突变的计算。为了解决这个问题，作者优化了 ASR 流程。所选序列均经过实验验证，并且在进化关系中具有足够的代表性。
β-1, 3-木聚糖酶（EC 3.2.1.32）可以水解β-1, 3-木聚糖内部的β-1, 3键，生成具有不同木糖单位的β-1, 3-木寡糖。通常，β-1,3-木聚糖酶是一种模块结构，由催化模块和一个或多个碳水化合物结合模块 (CBM) 组成。β-1, 3-木聚糖酶水解的底物是海藻细胞壁多糖的主要成分，来源广泛，为生物精制提供了良好的基础。β-1,3-木聚糖酶水解得到的单糖（木糖）可用于生产木糖醇、2,3-丁二醇等高附加值化学品。而β-1,3-木寡糖具有多种生物活性，如抗氧化活性、抗凝血活性和抗肿瘤活性。因此，β-1,3-木聚糖酶是制备β-1,3-木寡糖和藻类生物精制最有效的工具之一。目前，β-1,3-木聚糖酶是通过从微生物中筛选基因获得的，共有8种经实验验证的β-1,3-木聚糖酶交存于Uniprot。而这几种β-1,3-木聚糖酶都不能满足工业应用需求，因此，迫切需要一种具有高催化活性和热稳定性的β-1,3-木聚糖酶。
首先，作者将8个经试验验证的β-1,3-木聚糖酶去除信号肽和CBM,然后使用 MrBayes 3.2.6 版重建 β-1,3- 木聚糖酶的系统发育树,通过ANCESCON 获得了六个祖先 β-1,3-木聚糖酶。然后作者基于Discovery Studio 2019对FlaGM00308-T（最高催化性能）、AncXyl09、AncXyl10、AncXyl11、AncXyl12、AncXyl13、AncXyl14和TnB9K76（最高热稳定性）进行了分子对接和动力学模拟，作为预筛选过程。
FlaGM00308-T、AncXyl09、AncXyl10、AncXyl11、AncXyl12、AncXyl13、AncXyl14 和 TnB9K76 的 (-CDOCKER_ENERGY) 值分别为 7.17、7.15、5.271、.3、7、.3 和 .8。AncXyl09 的分子对接 (-CDOCKER_ENERGY) 值接近 FlaGM00308-T，表明 AncXyl09 的具有催化潜力。此外，FlaGM00308-T、AncXyl09、AncXyl10、AncXyl11、AncXyl12、AncXyl13、AncXyl14和TnB9K76的平均RMSD分别为9.76, 8.73, 7.03, 6.95, 11.04.39, 6.95, 11.39 .6.39 .5.36 ns。AncXyl09 的平均 RMSD 值介于 FlaGM00308-T 和 TnB9K76 之间，通过分子动力学模拟在 600 K 下 5 ns 进行分析。这表明 AncXyl09 具有良好的热稳定性，但不如 TnB9K76 具有嗜热性。因此，作者选择 AncXyl09 进行实验验证，因为根据理论计算，它结合了 FlaGM003008-T 的高催化活性和 TnB9K76 的高热稳定性。
AncXyl09 的最佳 pH 值和最佳温度分别为 6.0 和 55°C。在 55°C 下培养 24 小时后，活性保持在 80% 以上。与现有经实验验证的β-1,3木聚糖酶相比，AncXyl09具有更高的最适温度，这推断β-1,3-木聚糖酶祖先具有耐热性。AncXyl09在 50°C、55°C 和 60°C 下培养 32 小时后，AncXyl09 的相对活性分别为 67.94%、47.43% 和 45.51%。与现有的实验数据相比，AncXyl09 表现出比大多数现有 β-1,3-木聚糖酶优异的热稳定性。
AncXyl09对β-1，3-木聚糖、β-1，4-木聚糖和地衣多糖进行底物特异性检测。结果表明，AncXyl09不能水解β-1，4-木聚糖，但能水解β-1，3-木聚糖和地衣多糖，比活力分别为1.24U/mg和4.48U/mg。推测AncXyl09可能特异性地切割地衣中的β-1，3键。β-1，3-木聚糖酶是第一个报道的能够水解β-1，3-木聚糖和地衣的木聚糖酶。这表明祖先蛋白AncXyl09是一种杂交酶。
通过 TLC 和 HPLC 分析了对β-1,3-木聚糖和地衣水解的模式。如图 3A 和图 3B 所示，通过 TLC 检测到的整个孵育过程中，二糖 (X2) 是主要产物，而其他低聚糖由于含量低而几乎检测不到。HPLC进一步证明β-1,3-木二糖占绝大多数。地衣中绝大多数甘草糖在培养12小时后约占76%，在培养24小时后约占69%。而三糖(X3)、四糖(X4)的产生仅检测到少量。水解产物主要是二糖，可以显着促进低聚糖的分离纯化，而现有的其他β-1,3-木聚糖酶的主要水解产物占比不到40%。
β-1,3-木寡糖、地衣寡糖的抗氧化活性是通过DPPH自由基清除试验和羟基自由基清除活性等广泛使用的方法测定的。β-1,3-木寡糖、地衣寡糖的DPPH清除作用和羟基自由基清除活性随着浓度在0.1-1.5mg/mL范围内的增加而增加（图5A）。就羟基自由基清除活性而言，低含量（0.1-0.8 mg/ml）的低聚糖（β-1,3-木寡糖和地衣寡糖）都比抗坏血酸（Vc）更有效。然后它们对DPPH自由基的清除能力在1.5mg / ml时达到100％，接近抗坏血酸（图5B）。Wen-Sing Liang首先研究了β-1,3-木寡糖的抗氧化作用，其主要成分为β-1,3-木糖、β-1,3-木二糖和β-1,3-木三糖。对于 1 和 3 mg/mL 的浓度，清除活性分别为 1.4% 和 56.3%。作为比较，AncXyl09 水解的浓度为 1 和 1.5 mg/mL 的清除活性分别为 66.9% 和 71.8%。因此，AncXyl09水解物在DPPH自由基清除试验和羟基自由基清除活性方面表现出相对较好的能力。这些结果表明β-1,3-木寡糖和地衣寡糖在食品工业中具有应用潜力。
最后，作者通过 RING 服务器分析了 AncXyl09、FlaGM003088-T 和 TnB9K760 的残基相互作用网络。基于蛋白质残基之间的相互作用网络分析结果，更多的分子间作用力是AncXyl09良好热稳定性的保证，尤其是更多的氢键。此外，AncXyl09 有一个二硫键，位于 Cys158 和 Cys187 的残基中。因此，作者认为二硫键可能在 AncXyl09 的热稳定性中起重要作用。最后，作者进行了分子动力学模拟，结果也为了确定 AncXyl09 的热稳定性，对 AncXyl09、FlaGM003088-T 和 TnB9K760 进行了 5 ns 的分子动力学模拟。AncXyl09、FlaGM003088-T和TnB9K760在600 K的分子模拟轨迹表明TnB9K760的整体构象稳定，没有明显变化，而FlaGM003088-T的整体构象灵活性增加，结构在0-3 ns内松散，这可能导致活性位点体积增加和酶活性降低。而AncXyl09的整体构象在0.8ns内相对稳定，然后侧链逐渐延伸，但活性位点结构紧凑，保护良好，热稳定性较好。为了探索二硫键对 AncXyl09 热稳定性的贡献，作者结合均方根波动（RMSF）（图 6B）和 Gblock 结果找到二硫键附近的区域并进行区域分子动力学模拟轨迹分析。AncXyl09 在二硫键区域非常稳定，甚至在 0-4 ns 时优于极端嗜热的 TnB9K760。AncXyl09 整体构象的平均 RMSD (8.19 Å) 与二硫键区域的平均 RMSD (4.96 Å)（图 6C）显著不同（p 小于 0.0001）。然后，Ancxyl09 的 RMSD 在 4 ns 后急剧增加，曲线介于 FLaGM003088-T 和 TnB9K760 之间。因此，可以推断二硫键在 Anxyl09 的热稳定性中起重要作用。
整理：廖敏
DOI:10.1016/j.biortech.2021.125732
