今日推送的文章是发表在Angewandte Chemie-international Edition上的“Engineering Biocatalysts for the C-H Activation of Fatty Acids by Ancestral Sequence Reconstruction ”，作者为曼彻斯特大学的Bethan S. Jones。
对生物质中的脂肪酸进行选择性、一步式 C-H 活化是可持续化学中一个有吸引力的概念。生物催化已显示出产生高价值羟基酸的希望，但迄今为止，酶的发现依赖于费力的筛选并产生有限的命中，其主要氧化脂肪酸的亚末端位置。在这里，作者证明祖先序列重建（ASR）是探索多域、自给自足的 P450 单加氧酶家族的序列活性景观的有效工具。
1 系统发育和祖先中间体的推论
为了生成具有多样化催化范围的酶组，通过数据库搜索收集并整理 CYP116B 序列。作者获得了 467 个 CYP116B 序列，其中包括所有三个结构域（P450/血红素、铁硫和还原酶）。这些序列主要来源于两个主要门，放线菌门和变形菌门。与先前表征的现有 CYP116B 序列的嗜热组相比，大多数序列是从嗜温菌中分离的。使用推理程序祖先序列预测图形表示 (GRASP)，通过联合重建最大似然方法，推断出总共 11 个全长多域 CYP116B 祖先（图 2，树中突出显示的节点）。N106 和 N115 在 25 °C 时表现出比所有其他 CYP116B 酶（包括其直系后代 P450-TT）更高的表达，P450-TT 是表达量最高的现存形式。
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图2
2 热稳定性曲线
作者通过在一定温度范围（25-80°C）下孵育蛋白质来评估 CYP116B 祖先的热稳定性，并通过改变特征性 P450 光谱来评估 P450 全酶的损失。使用了两个孵育时间（15 和 60 分钟），这使作者能够确定每个祖先的 15T50 和 60T50 稳定性（表 1）。在 CYP116B 树的不同祖先中观察到了广泛的热稳定性（15T50 38-54 °C 和 60T50 <30-55 °C）。60T50 值通常低于 15T50 值，表明对长时间加热的耐受性较低，特别是在稳定性较低的祖先和野生型酶中，例如 15T50 <45 °C（图 2、表 1）。P450-AX、-TT 和 -TB 是最耐热的现存形式，与之前的研究一致，15T50 值分别为 54、53 和 52 °C，比 P450- 的值高 10°C 以上。JT 和 -AT 是热稳定性明显较差的形式，源自最佳生长温度通常较低的生物体。 仔细观察与三维结构相关的序列比较表明，变异集中在祖先的环中。蛋白质支架更大的灵活性可以解释祖先相对于 P450-TT 的热稳定性降低的原因。氨基酸组成的一般比较显示祖先和现存形式之间具有高度相似性，与 P450-TT 相比，祖先中的氨基酸略有转向疏水性更强的氨基酸。不同谱系祖先的 15T50 值似乎存在相当大的变异性，中间节点 15T50 在约 42 至 51 °C 之间变化。在终止于 a 的谱系中可以看到随着时间的推移获得热稳定性的总体趋势。耐热的现有形式（即 P450-AX、-TT 或 -TB）。
3 原始酶的催化
在多结构域酶中，跨结构域的环和连接体变异可以影响结构域之间的动态和相互作用。使用五倍高的酶负载量检查了祖先区域选择性指纹（图 2）。在这些条件下，所有自给自足的祖先都具有催化活性，这意味着所有祖先中都维持了电子转移，并证明了 ASR 促进活性电子传输链工程化的能力。在两种 P450 负载量下，N70、N106 和 N115 的祖先形式的周转率最高，这些形式也表现出最佳的表达。ASR 也可以成功应用于自给自足的 CYP116B 单加氧酶的三结构域家族，产生自给自足的单多肽祖先蛋白，这些蛋白质全部正确折叠，电子跨域转移并保留酶活性。
4 区域选择性的进化转变
整个祖先面板中，在 ω-5 和 ω-1 之间的每个位置检测到癸酸的羟基化；然而，没有观察到任何中链 ω-6 羟基化或更接近羧酸盐的羟基化。在 N0 和 N374 中，选择性发生了意想不到的转变，偏向于 ω-2 位置而不是 ω-1 位置。在任何野生型产物分布中均未发现这种对 ω-2 位置的新颖亚末端偏好。相比之下，其他深层祖先 N1、N104、N3 和 N23 显示出对 ω-1 羟基化的偏好（图 2）。除了 P450-TT 和 -TB 之外，更深的祖先酶往往比所检查的更近的祖先或现存酶更具区域选择性。中链羟基化在两个不同的谱系（N70 和 N106）中独立出现，其祖先主要是 ω-1 羟化酶（N1、N3 和 N104）。在 N70 谱系中，非选择性祖先（N70：38% 中链和 32% 亚末端）产生了两种非选择性野生型酶 P450-JT 和 -AX，它们对 ω 表现出轻微的偏好。分别为 -5 (51%) 和 ω-1 (48%) 位置。相比之下，P450-TT谱系在N106祖先中更早地发展出对中链羟基化的偏好，并导致P450-TT转向完全中链羟基化。事实上，对于 N115 和 N106，主要产物在 ω-5 位羟基化，转化率为 99%。因此，与 CYP116B 细菌祖先相比，该谱系显示出区域选择性的显着转变，并表明 P450-TT 不寻常的区域选择性的进化途径。
5 对区域选择性转变的结构
在探索了祖先 CYP116B 酶的区域选择性范围后，作者比较了它们的整体序列和活性位点内的序列（图 3），以确定选择性的决定因素。与 P450-TT 全酶相比，祖先序列同一性范围从 59%（较早的祖先）到 77%（较近的祖先）。大多数非保守残基发现于预计表面暴露的区域（图3a），每个结构域的核心区域有更多保守性。活性位点的唯一变化是两个连续的氨基酸（Ala205Thr 和 Phe206Trp），这增加了活性位点极性，并且存在于除了最接近 P450-TT 的两个（N115 和 N106，图 3b）之外的所有祖先中。这表明极性更强的活性位点可能有利于 CYP116B 家族中的亚末端羟基化。比对中的 467 个初始现存序列中只有 17 个缺乏大多数特征化祖先序列中存在的 Thr-Trp 基序，而是具有 Ala-Phe、Ile-Trp 或 Gln-Phe 残基，表明这些可能是控制脂肪酸羟基化区域选择性的关键活性位点位置。此外，分子对接模拟显示，在含有Thr-Trp活性位点基序的九个祖先模型中，底物朝向亚末端位置。相比之下，对于具有 Ala-Phe 基序的 P450-TT 的两个最接近的祖先（N115 和 N106），羧基锚定在替代的 Thr 残基上，有利于中链选择性。为了更好地理解与 Ala205Thr 和 Phe206Trp 保守基序相关的 ω-5 到 ω-2 或 ω-1 产物的选择性转换，对 P450-TT 中的 Ala205 和 Phe206 进行突变以获得相应的单突变体和双突变体。双突变体比 P450-TT 更活跃，这可以解释这些残基在其他野生型序列中的突出性。尽管ω-5羟基化仍然是最受欢迎的产物，但观察到ω-4和ω-3羟基化烷基链的比例增加（图3c），这表明活性位点极性的增加对区域选择性有影响。
图3
