文 | 农牧简说
编辑 | 农牧简说
介绍
柑橘类黄酮可以与胃肠道微生物群相互作用，影响宿主代谢健康。本研究未发表的数据分析表明，饲喂柑橘类黄酮提取物对泌乳奶牛瘤胃发酵参数和瘤胃微生物结构无显著影响。
在反刍动物中，尚不清楚柑橘类黄酮是否通过瘤胃上皮吸收。据报道，已知瘤胃细菌具有部分去糖基化柚皮苷和橙皮苷的能力。
我们推测后肠微生物可能进一步提高柑橘类黄酮的生物利用度，促进黄酮代谢物的产生。
因此，研究柑橘类黄酮对奶牛后肠道微生物群和代谢的影响，对于表征柑橘类黄酮的作用及其对奶牛免疫状态的影响至关重要。
我们推测，在哺乳奶牛日粮中添加CFE可能通过改变后肠菌群和代谢物，促进后肠碳水化合物发酵，改善免疫状态。
这些改良将对奶牛的生产能力产生有益的影响。因此，本试验旨在评估饲粮中添加CFE对产奶量、血清免疫指标、粪便挥发性脂肪酸、粪便微生物群和粪便代谢组学特征的影响。
材料与方法
2.1动物伦理声明
本实验所需动物的照料和处理程序已由北京农业大学动物使用伦理委员会批准。本试验按照《中国动物护理和动物福利实验方案指南》进行。
2.2柑橘类黄酮提取物的制备、动物和处理
产品CFE购自陕西夏洲生物科技有限公司(中国西安)。从白柑橘果皮粉中提取柑橘类黄酮。
简而言之，用15 L碳酸钙溶液(0.1%)在100℃下提取1 kg柑橘皮粉两次，提取1.5 h，然后在37℃下减压旋转蒸发至干燥。
采用AB-8大孔吸附树脂柱富集总黄酮，80%乙醇洗脱(柱体积为2倍)。收集并浓缩至干燥待用。
采用硝酸铝分光光度法与芦丁当量测定黄酮类化合物含量(56.83%)。采用高效液相色谱法，根据Jiang等人的方法。CFE的化学成分见表S1。
2.3采食量、产奶量及成分
称重日采食量和日采食量，计算干物质采食量。每周从TMR中提取的所有饲料和精粮样本进行干燥和研磨，并将代表整个研究的每种成分的单一混合物保存在-20℃，直到化学测定。
TMR和ort样品在55℃的强制空气烘箱中干燥48小时，然后通过1毫米筛网进行研磨，然后进行分析。
对样本进行DM分析，灰分，醚提取物，粗蛋白质和淀粉。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的浓度分析参照Van Soest et al ，中性洗涤纤维的测定采用热稳定的a-淀粉酶和亚硫酸钠。NEL是根据NRC表列饲料值计算的。
在所有3次挤奶的最后3天(d 19e21)采集牛奶样品，并用2-溴-2硝基丙烷-1,3-二醇保存。
将每头奶牛的日乳样品根据MY按比例合成，运到北京奶牛中心。采用红外光谱对乳脂、蛋白质、乳糖、SCC和尿素氮进行分析。
3.5%脂肪校正乳按Sklan et a计算。能量修正乳(ECM)是根据Sjaunja等的公式计算的。
2.4血清免疫参数
在每个周期的第16天早上挤奶后和喂食前，将奶牛尾部血管的血液取到没有凝块激活剂的真空管中。
血清在2000×g下室温离心15 min，保存在-20℃待分析。免疫球蛋白A、IgG、IgM、白细胞介素1b 、IL-2、IL-4、IL-6、肿瘤坏死因子- A 、干扰素g 、LPS、LBP、可溶性LPS受体CD14 、成纤维细胞生长因子21 、脂联素的浓度根据供应商的说明书使用商用ELISA试剂盒进行分析。所有ELISA数据均由微孔板阅读器。
2.5粪便取样和粪便挥发性脂肪酸分析
在每期的第16天早上挤奶后和喂奶前，使用新手套手动采集新鲜粪便样本到无菌管中。粪便管立即在液氮中速冻并保存在-80℃。
使用Petri等人(2019)的方法对粪便样本中的VFA浓度进行了轻微修改。简单地说，将每个样品的2g解冻粪便与2ml蒸馏水混合。
然后，在悬浊液中加入600 mL内标4甲基戊酸和0.4 mL 25%磷酸。这些混合物在15,000×g, 4℃下离心20分钟。
随后，上清液通过气相色谱仪配备火焰电离检测器和DB-FFAP毛细管柱。进样器和检测器的温度分别为170和190℃。烘箱温度从100℃提高到250℃。
2.6实时定量PCR扩增
使用e.zn.a.粪便DNA试剂盒按照制造商的方案提取每个粪便样本的总微生物DNA。
采用NanoDrop 2000分光光度计和1.1%琼脂糖凝胶电泳分析DNA的浓度和完整性。提取的DNA样本保存在-80℃，等待进一步处理。
采用实时荧光定量PCR技术测定了8种粪便细菌的相对丰度，包括拟杆菌-普氏杆菌-卟啉单胞菌群、双歧杆菌、球芽梭菌-直肠真杆菌群、I型梭菌群和XIVab型梭菌群、大肠杆菌、乳酸杆菌等。
这些目标细菌的引物序列列于表S3。每个样品提取的DNA标准化至8 ng/mL进行qPCR。qPCR反应一式三次，总容积为25 mL。
每个反应体系包括12.5 mL 2 SYBR Green Master Mix ，每种引物1 mL，提取的DNA样品2 mL，和9.5 mL无DNase/RNase水。
qPCR反应在Roche LightCycler 96 中进行。在95℃下循环3 min，然后在95℃和各自的退火温度下循环40次，分别为15 s和30 s，最后在72℃下循环15 min。
每个目标细菌的丰度表示为每个细菌目标16S rRNA基因丰度与总细菌丰度的比例(%)，使用效率校正的2DDCt方法。
2.7粪便细菌16S rRNA测序及生物信息学分析
使用定量洞察微生物生态学版本2管道筛选和鉴定测序reads的操作分类单位 。
质量评分<20的序列在下游分析前被移除。
通过USEARCH及其数据库。序列比对和聚类使用PyNAST 和16S rRNA基因数据库SILVA数据库(版本123)，使用基本的局部对齐搜索工具。
根据序列与数据库的3%不相似度来确定OTU的身份，保留聚类次数大于10个reads的OTU。
使用RDP分类器(版本2.2)和GreenGenes数据库为每个OTU分配分类。
丰度估计是通过从界到属的分类水平上具有相同分类分配的OTU的读取计数求和来计算的。
Shannon多样性指数、Chao丰富度估计器和所有其他otu级alpha多样性指数使用MOTHUR(版本1.30.1)计算。
采用相似度分析来确定细菌群落结构的差异。利用未加权和加权的UniFrac距离计算Beta多样性，并利用主坐标分析(PCoA)图进行可视化。
利用群落系统发育调查预测各样本的功能特征。采用Bonferroni方法对最终P值进行错误发现率校正，显著性阈值为P < 0.05。
2.8粪便代谢物提取，LC-MS/MS分析，数据处理
根据Yu等人(2017)的方法提取粪便代谢物，并进行了修改。将100毫克的粪便样品溶解在1毫升来自milliq净水机的冰水中系统。
将混合物在13000×g和4℃下旋转60 s，离心15 min。收集上清并冰冻保存，剩余的粪便颗粒通过加入1 mL冰冷的LC-MS级甲醇进一步提取。
将混合液在13000×g、4℃下涡流离心15分钟。将上清液混合后转移到带有0.22 mm过滤器的新鲜Eppendorf管中，然后在4℃、15000×g下离心10分钟。
最后，将粪便滤液注入UHPLC系统与Triple TOF 5600 耦合。色谱柱为UPLC BEH Amide柱，流动相为a，流动相为B。
流速0.40 mL/min。洗脱梯度为5% B，洗脱时间为0至2分钟，洗脱时间为5%至95% B，洗脱时间为2至12分钟，洗脱时间为95% B，洗脱时间为12至15分钟，洗脱时间为95%至5% B，洗脱时间为15至17分钟。
质谱以正离子或负离子模式操作，如Wang等人(2019)所述。
结果
3.1采食量、产奶量及成分
饲喂高达150 g/d的CFE对奶牛DMI没有影响(表S4)。饲粮中添加CFE显著影响了MY (P=0.028)、ECM (P=0.040)、乳糖率(P < 0.001)、产量(P < 0.001)和SCC (P=0.003)。
添加CFE100和CFE150的奶牛MY显著高于con (P < 0.05)， ECM显著高于con (P < 0.05)。
Quad P < 0.027)和百分比(Lin P < 0.001;Quad P < 0.001)随CFE添加水平的增加呈线性和二次增长。
SCC随CFE用量的增加呈线性下降(P < 0.043)。产奶率(以ECM/DMI表示)随CFE的增加呈二次增长趋势(P < 0.090)。
不同处理的乳脂和乳蛋白产量或百分比、乳效率(以MY/DMI、FCM/DMI表示)和MUN相似(P > 0.10)。
3.2血清免疫参数
补充CFE显著影响血清IgG (P=0.037)、IL-1b (P=0.029)、IL-2 (P=0.034)、IL-6 (P=0.011)和LPS (P=0.034)浓度(表1)。
饲粮添加CFE对血清IgG浓度有二次影响(P < 0.024)， IgG在CFE50时达到最大值。
添加CFE有影响IgA浓度的趋势(P < 0.082)，而CFE的剂量效应不明显。
增加CFE包含量可线性降低血清中il - 1b、IL-2 、IL-6和TNF-a 的浓度。
CFE50和CFE150组血清LPS低于con组，血清LBP呈二次效应(P < 0.017)，在CFE150组最低。
血清ADPN随CFE水平升高呈线性升高(P < 0.043)。添加CFE对血清IgM、IL-4、IFN-g、sCD14、FGF21浓度无显著影响(P > 0.10)。
讨论
柑橘提取物已成为一种有前途的植物性饲料添加剂，可改善反刍动物的生产性能和健康。
柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和去皮苷通常是柑橘类水果或副产品中主要的活性类黄酮。
黄酮类化合物中柚皮苷和橙皮苷含量最高。通常，柚皮苷和橙皮苷需要水解成其活性苷元形式柚皮苷和橙皮苷才能发挥各种促进健康的活性。
本研究表明，CFE对泌乳中期奶牛的免疫状态和产奶性能有明显的有益影响。
添加CFE可通过调节血清IgG、IL-1b、IL-2、IL-6、TNF-a和LPS水平改善奶牛免疫代谢状态。
CFE的抗炎作用与促进后肠发酵，增加益生菌类群拟杆菌、相结杆菌、双歧杆菌和prausnitzii，减少梭菌群XIVab、大肠杆菌有关。
添加CFE还可调节后肠鞘脂代谢和次级胆汁酸的产生，这有助于CFE对脂质和肠道稳态的保护作用。
进一步了解CFE对奶牛代谢健康影响的调控机制及其在奶牛胃肠道中的代谢物，对于CFE作为饲料添加剂在乳制品行业的进一步应用至关重要。
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