【实验目的】
（1）掌握溶菌酶—CTAB—蛋白K—冻融法提取土壤微生物基因组DNA的原理。
（2）掌握采用溶菌酶—CTAB—蛋白K—冻融法提取土壤微生物基因组DNA的方法及操作过程。
（3）熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的操作过程。
【实验原理】本实验采用溶菌酶—CTAB—蛋白K—冻融法提取土壤微生物基因组DNA，主要原理如下：
（1）土壤微生物的释放。土壤微生物除了吸附于土壤颗粒表面，还较多地存在于土壤间隙。采用2％偏磷酸钠为分散剂，配合磁力搅拌器搅拌分散土壤微生物，使其从土壤间隙及颗粒中释放出来。
（2）土壤微生物的洗涤。土壤中含有较多的腐殖质、腐殖酸等杂质，它们容易与微生物细胞中释放中的DNA结合，从而降低DNA得率及质量，影响后续的分子生物学操作。因此，采用可溶性PVP去除土壤中的杂质。
（3）微生物细胞的破碎及DNA的释放。土壤中的微生物较难破壁，本实验采用多种物理、化学和生物结合的方法联合破壁和破膜，使DNA得以游离出来。化学裂解法包括用溶菌酶破坏细菌细胞壁，采用去污剂CTAB破坏细胞膜等；物理破碎法包括用超声波破碎细胞，采用物理冻融法使微生物细胞骤冷骤热而发生破碎；生物酶解法有用蛋白酶K去除DNA上结合的蛋白质，使DNA释放出来。
（4）杂质的去除。CTAB可以与多糖、变性蛋白细胞碎片结合而形成不溶物，同时也可去除部分腐殖酸。另外，本实验还采用添加CaCl2和小牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）以进一步去除腐殖酸。Ca2 可与DNA竞争结合腐殖酸，形成稳定的腐殖酸钙，在后续的处理中再被去除；BSA可以通过其上富含赖氨酸的阳离子与带负电荷的腐殖酸的可逆结合，降低腐殖酸与DNA的结合，同时BSA可以封闭其他杂质对酶活性的抑制，避免DNA降解，提高DNA的纯度与浓度。
（5）DNA的纯化。本实验采用氯仿/异戊醇抽提去除蛋白质。
（6）DNA的分离。本实验采用0.5体积的25％PEG8000沉淀基因组DNA，70％乙醇去除溶于水的盐及杂质。
（7）RNA的去除。
【实验材料、试剂及仪器】
1．实验材料各类土壤。采集后过2mm筛，去除石块及枯枝落叶，贮存于－70℃或冻干备用。
2．实验试剂
（1）土壤洗涤液：2％（m/V）偏磷酸钠（pH8.5），1％（m/V）聚乙烯吡咯烷酮K30（poly-vinylpyrrolidone, PVP）。
（2）DNA提取缓冲液：100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA-Na2（pH 8.0），100mmol/L磷酸钠缓冲液，1.5mol/L NaCl，1％CTAB。
（3）溶菌酶：用无菌双蒸水配成50mg/mL的储存液（分装成小管），不需灭菌，存于－20℃。
（4）蛋白酶K：用无菌双蒸水配成20mg/mL的储存液（分装成小管），不需灭菌，存于－20℃。
（5）2％SDS溶液：用20％SDS稀释。
（6）10％CaCl2溶液：100mL水中溶解10g无水氯化钙，用0.22μm滤膜过滤除菌。
（7）10mg/mL BSA溶液：用无菌双蒸水配成10mg/mL的储存液（分装成小管），不需灭菌，存于－20℃。
（8）氯仿/异戊醇（V∶V＝24∶1）。
（9）异丙醇。
（10）70％乙醇：70mL无水乙醇用无菌水定容至100mL。
（11）25％PEG8000：25g PEG8000用无菌水溶解，定容至100mL，贮于4℃冰箱，备用。
（12）含10μg/mL RNase A的TE缓冲液：10mL TE缓冲液［10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），121℃高压灭菌20min，备用］中加入10mg/mL RNase A溶液10μL。（13）琼脂糖凝胶电泳相关试剂。
3．实验仪器
台式高速离心机（每8人1台）恒温水浴锅（每8人1台）1．5mL和10mL无菌离心管（每人4支）移液器（每2人1套）1mL和200μL无菌吸头（每人10支）吸水纸（每4人1卷）磁力搅拌器（每4人1台）50mL小烧杯（每人2只）琼脂糖凝胶电泳相关仪器
【实验步骤】
（1）取土壤样品1g，置于50mL烧杯中，加入10mL土壤洗涤液，磁力搅拌器搅拌10min，10000r/min离心5min，取沉淀。
（2）加入10mL DNA提取缓冲液，磁力搅拌器搅拌10min，10000r/min离心5min，弃上清液。
（3）重复步骤（2）至少2次以上或至上清液颜色变淡为止。将土壤沉淀分装于4支1.5mL离心管中。
（4）取沉淀重悬于500μL裂解液中，加入10％CaCl2至终浓度2％，加入10mg/mL BSA至终浓度1μg/mL，加入溶菌酶至终浓度1mg/mL，颠倒混匀，37℃水浴1h，超声波（50W）处理30min。
（5）加入蛋白酶K至浓度100μg/mL，65℃水浴1h，其间在冰上反复冻融3次。
（6）加入等体积的氯仿/异戊醇抽提，颠倒数次至呈乳白色，10000r/min离心5min，取上层清液至新的1.5mL离心管中。
（7）加入0.5体积的25％PEG8000，4℃放置过夜，12000r/min离心10min。
（8）加入500μL70％乙醇，室温放2min，12000r/min离心5min，弃上清液。
（9）取沉淀，室温晾干，溶于100μL含10μg/mL RNase A的TE缓冲液中，37℃水浴放置1h。
（10）取10μL样品进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
【实验注意事项】
（1）搅拌要充分，以使分布在土壤间隙内或黏附在土壤颗粒上的微生物分散出来，否则会导致DNA得率下降。
（2）由于土壤中含有较多的杂质，所以土壤洗涤这一步骤非常关键。对于不同的土壤，洗涤时间不同，要注意摸索。
（3）用于DNA提取的土壤不可太多也不可太少，1g土壤洗涤完全要分装在4支1.5mL离心管中，太多会导致DNA裂解不充分，得率低，质量下降；太少的话会导致DNA量少，不能满足后续的实验操作。
（4）土壤裂解时，土壤重悬要用吸头或牙签搅拌均匀，肉眼不可看到土壤团块存在，否则也会导致细胞裂解不完合，导致DNA得率低或质量差。
【典型实验结果分析】1．理想实验结果（见图5.4）DNA分子大于23kb，纯度较高，可直接用于后续的分子生物学操作。
图5.4 土壤微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳结果1M：DNA分子大小标准参照物；1～6：土壤微生物总DNA2．
典型实验结果1（见图5.5，泳道13）加样孔很亮，表明有蛋白质污染。解决办法：依次用酚/氯仿/异戊醇、氯仿/异戊醇抽提，去除蛋白质。
4．典型实验结果2（见图5.5，泳道1、5、6、7、10、11、12）在凝胶前端有RNA条带，表明RNA未去干净。解决办法：加入RNase，重新酶解。
5．典型实验结果3（见图5.5，泳道2、4、8、9）整个泳道中间空心，且肉眼可在凝胶上见到黄褐色，表明有腐殖酸，将DNA推向前沿。解决办法：重新提取，增加提取液洗涤次数，必要时可在4℃浸泡过夜，特别要注意在进行腐殖酸去除相关的操作时要规范。
6．典型实验结果4（见图5.5，泳道3）无DNA。解决办法：重新提取，操作时注意土壤的分散要充分，各步骤的离心速度要照要求设定，上清液的吸取要小心。
图5.5 土壤微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳结果2
M：DNA分子大小标准参照物；1～11：土壤微生物总DNA6．
典型实验结果5（无电泳条带）DNA沉淀呈棕色，难溶解，难以进行酶切及PCR扩增，表明DNA中含有杂质。解决办法：重新提取，增加提取液洗涤次数，至上清液颜色变淡为止，必要时可在4℃浸泡过夜。
【实验讨论】
问题：PEG8000（聚乙二醇8000）沉淀法的适用对象及优点有哪些？答：DNA溶于水，PEG8000可以与水分子结合，破坏DNA表面和水的膜，从而使DNA沉淀析出。用PEG8000于4℃过夜沉淀DNA虽然历时较长，但适合于大片段DNA，尤其是基因组DNA的沉淀。虽然此法得到的DNA得率略低，但可有效去除腐殖质和腐殖酸。
