根据其活性和热稳定性筛选该文库中存在的每个突变体。两种突变体通过与野生型相比其比活性的增加来鉴定(F243I和F243W)，四种突变体通过其热稳定性的增加来鉴定(T96M、Y127G、N246D和N246M)。
LCC的热稳定性也依赖于二价离子的存在，如钙2 。用二硫键交换阳离子结合位点(D238C/S283C)使解链温度增加了9.8℃(Tm = 94.5℃)。
活性增加的突变(F243I和F243W)与二硫键形成(D238C/S283C)的结合导致了新型LCC突变体的产生，其表现出甚至更高的解聚活性和热稳定性。
结合用ICC和WCC突变鉴定的不同热稳定性热点突变提供了两种新的LCC突变体其呈现显著的PET降解特性，它可以在创纪录的时间内几乎完全降解消费后的PET废物(PcW-PET)。
即，ICCG和WCCG分别在仅20小时和15小时内解聚了82%和85%的PET。
此外，通过调整生物反应器条件下酶和PET量之间的比例(3 mg酶/1g PET)，LCC突变体解聚速率得到提高，在不到10小时内达到90%的产率。
该研究代表了聚酯酶向工业应用的合理工程中的基准。
自然界——尤其是植物——也使用类似于塑料的聚合物用于结构目的，例如，在植物中用作支持组织的木质素这些生物聚合物出现在大约4.5亿年前，在地球上第一批植物建立之后的奥陶纪晚期植物细胞壁的主要成分包括几种生物聚合物，如纤维素(20–50%)、半纤维素(15–35%)和木质素(10–30%)。
其他化合物，如蛋白质(3-10%)、脂类(1-5%)、可溶性糖(1-10%)和矿物质(5-10%)作为次要成分虽然这种所谓的顽固生物质的降解是碳循环的重要组成部分，但鉴于底物的不溶性，对其消化中所涉及的酶的研究一直具有挑战性。
在这个意义上，生物质相关酶学可以被视为更近的吃塑料酶领域的先驱，该领域也关注与固体界面相互作用的酶。
此外，天然聚合物具有与合成塑料相似的物理和化学性质。
例如，纤维素也是一种半结晶聚合物，组织成结晶和无定形微区。
然而，生物质加工酶的技术应用和生物分子工程的历史比其塑料对应物要长得多。
在这一节中，我们回顾了一些积累的关于天然聚合物的生物和工业生物降解的知识，特别强调了对合成塑料的酶回收的新兴努力的可能相关性。
植物细胞壁呈现有组织的纤维素微纤维片层，形成组织良好的基质轴簇纤维素是细胞壁的主要成分，还含有半纤维素和木质素。
纤维素是由线性β-1，4-葡聚糖链(d-葡萄糖单体通过β-1，4-糖苷键连接)。
葡聚糖链的聚合度因来源而异，重新排列成高度组织化的直径为3-5纳米的结晶微纤维，主要由分子内和分子间的氢键和范德华力维持半纤维素是复杂的支链和直链多糖，具有不同的结构成分。
主要包括d-木糖，d-甘露糖和其他取代的糖木质素是木质纤维素生物质中存在的第三种主要生物聚合物，由衍生自p-羟基苯基(H)、愈创木基(G)和紫丁香基(S)单体单元。
木质素的结构组成因植物种类和细胞组织类型而异整体结构围绕纤维素微纤维排列，其表面通过氢键与半纤维素相互作用。
木质素又通过共价键连接到半纤维素。
尽管许多纤维素和半纤维素水解酶(纤维素酶和半纤维素酶)是已知的，并用于各种行业。
如饲料、食品、发酵、纺织和生物燃料生产，但生物质难以生物降解仍是一个问题，并与两个主要的内在性质有关:异质性和结晶度。
异质性是指纤维素、半纤维素和木质素聚合物的复杂混合物，根据植物类型而变化。
木质素和半纤维素的存在降低了纤维素酶对木质纤维素底物的可水解部分的可及性，这在纤维素生物聚合物几个预处理步骤通常被整合到工业过程中，以通过去除木质素和半纤维素部分来使底物去络合，并促进纤维素酶接近可水解的纤维素。
结晶度是纤维素中葡聚糖链高度有序堆积的结果，这导致半结晶形态纤维素酶优先攻击半结晶纤维素的无定形区在工业过程中利用几种纤维素酶的协同作用来确保最佳的水解速率。
木质纤维素材料的酶促估价通常意味着将其转化为用于生物燃料生产的可发酵糖该工艺包括三个主要的连续步骤:粉碎、预处理和酶水解。
尺寸减小和预处理步骤促进了酶对固体生物质的可及性，这对于其水解是必不可少的木质纤维素粉碎改变了其结构并降低了纤维素聚合和结晶度木质纤维素材料的预处理主要基于使用硫酸或氢氧化铵、蒸汽或热水这些步骤有助于从细胞壁中去除半纤维素和木质素。
这反过来会增加酶对完整纤维素的可及性，虽然细节没完全了解然而，大多数用于去除木质素和半纤维素的酸性预处理也增加了纤维素的结晶度。
并可能抑制纤维素酶的活性此外，大多数热化学生物质预处理形成分解产物，例如酰胺、呋喃和咪唑，其可能抑制生物下游处理这些降解产物通常也对环境有毒。
来自几种革兰氏阳性菌的纤维素酶，例如梭菌, 纤维单胞菌属，以及高温单孢菌和真菌。
如里氏木霉和A.尼日尔已经广泛用于工业应用大多数纤维素酶和半纤维素酶用于获得单糖，如葡萄糖和木糖，然后发酵成乙醇酶水解是生物燃料生产中的主要成本组成部分。
占生物乙醇生产成本的25%该值不仅取决于酶生产成本，还取决于水解效率、发酵生产率和最终乙醇产量已经开发了几种策略来降低成本和提高水解产率，例如使用更便宜的底物进行酶生产。
但是大多数努力都是针对通过在固体底物上更大的稳定性和更高的比活性来提高工业效率的酶工程。
鉴于木质纤维素材料的复杂性，各种酶之间的协同作用对于它们的自然生物降解是必不可少的这在工业生物质估价过程中也是真实的。
该过程通常使用酶混合物，该混合物尤其包含内纤维素酶和外纤维素酶三种类型的纤维素酶。
都特异性水解β-1，4-d-需要纤维素的葡聚糖键来实现完全解聚成d-葡萄糖单体:内切-β-1，4-葡聚糖酶在内部水解葡萄糖链，暴露出额外的游离和非还原末端；β-葡萄糖苷将纤维二糖切割成最终d葡萄糖单体。
和纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，外切型纤维素酶，水解聚合物链的暴露末端，释放纤维二糖内纤维素酶呈现一个开放的底物结合槽。
非常适合于结合长的纤维素片段，而外纤维素酶具有一个较小的口袋，一次只能通过一个或两个糖进入。
纤维素酶属于糖苷水解酶(GH)超家族根据CAZy数据库，这个超家族由168个家族组成，不断有新成员被发现。
观察到GH序列和3D结构的巨大多样性，但是它们的作用模式在不同家族之间是保守的。
糖苷水解酶通过两种机制水解葡聚糖链，导致C1碳的立体化学转化或保留。
这两种机制都基于两种必需的羧酸侧链氨基酸，Asp和Glu，它们位于聚合物链的每一侧。
一个氨基酸作为碱性催化剂，在有水的情况下攻击1糖环的异头碳。
其他催化残基，将质子转移到释放的苷元上的酸性催化剂底物结合口袋的几何形状和氨基酸组成决定了GHs使用的机制。
木质素生物降解可以激发C–C主链合成聚合物的酶处理，它依赖于与纤维素水解完全不同的化学。
负责木质素降解的微生物，其使用芳香族化合物作为其碳源，通过氧化共底物如O攻击木质素2或者H2O2。
诸如木质素-LiP 、锰-MnP和通用-VP过氧化物酶或漆酶的氧化酶由白腐真菌和消耗木质素的细菌分泌，以将木质素解聚成各种芳香族化合物当开始氧化氧从木质素中移除电子时，解聚反应开始，产生几个自由基阳离子反应中间体。
这些中间体依次经历几个完全独立于木质素降解酶的化学过程漆酶是多铜氧化酶，利用氧来处理酚类底物2作为电子受体。
结合芳香底物的漆酶表面被认为靠近T1铜位点，即三个铜中心(T1、T2和T3)中氧化还原电位最高的铜离子。
但是漆酶在分解占木质纤维素底物90%的木质素的非酚类亚单位时并不那么有效。
提高漆酶效率的一个策略是向反应混合物中加入芳香族分子:由于漆酶对这些介体的作用而形成的化学氧化剂将确保非酚类化合物的分解过氧化物酶利用H2O2以催化木质素解聚。
它们呈现保守的3D结构，在活性位点上有一些差异。
例如，MnP将酸性氨基酸加工到它的活性位点来协调Mn3 而在木质素过氧化物酶中，酸性氨基酸被暴露于溶剂的色氨酸取代，这涉及与底物的电子转移过程。
多用途过氧化物酶既提供用于锰结合的酸性氨基酸，也提供暴露的色氨酸。
蛋白质工程方法已经应用于木质纤维素降解蛋白质，以改善天然酶的性质，特别是在温度和pH范围内的比活性和稳定性方面。
与塑料消化酶的情况相反，DE方法通常优于理性方法DE方法受自然选择过程的启发，试图在实验室水平和短时间尺度上再现随机多样化和选择的循环。
多样性是通过在多个位置引入随机DNA突变而产生的，因此产生了数千到数百万个变体的集合。
然后使用针对所需特性的筛选试验来测试这些变体。
这种方法可以应用于功能和结构数据不可用的蛋白质，因为它在一个迭代和盲目的过程中探索蛋白质的性质。
然而，困难在于建立可用于高通量但仍能作为真实应用的忠实代理的筛选试验。
DE方法与理性和半理性方法形成对比，后者需要感兴趣蛋白质的功能和结构知识，或者，最近，也可以基于相关酶家族序列的统计分析可以使用结构分析和建模工具来预测蛋白质中给定突变的影响。
理性的方法通常会提出一小组有针对性的突变，然后对其进行单独测试。
然而，这些收藏比盲德的要小得多。
这简化了筛选试验的设置，尽管理性的方法可能无法预测最有利的突变。
合理和半合理的计算机方法已被用于提高几种纤维素酶的稳定性例如，超耐热β-1，4-内切葡聚糖酶Cel12B的分析海洋热蠓使用多序列比对的序列允许鉴定感兴趣的突变点。
参考文献
《来自天然聚合物的教训》
