《半夜的夜叉姬》是一部讲述人类和妖怪之间互相斗争的动画片。主人公夜叉姬是一个妖怪猎人，她与伙伴们一起打击各种妖怪。在一次任务中，夜叉姬遇到了一个名为“半夜”的妖怪，半夜开始对夜叉姬产生了兴趣。夜叉姬与半夜之间的关系逐渐发生变化，而人类和妖怪之间的斗争也更加激烈。
永远、刹那、诸叶，是继承了妖怪与人类血脉的半妖少女们。幼时被卷入森林大火而分离的双胞胎少女，永远与刹那。永远通过能穿越时代树时空的隧道，从战国时代来到了现代。
她被戈薇所在的日暮家养育长大，成长为精通武道的女初中生。
与此同时，留在战国时代的妹妹刹那，在已经成为除妖师首领的琥珀手下以除妖为业。
诸叶是戈薇与犬夜叉的女儿，身为赏金猎人的她拥有“妖怪*手诸叶”这一称号，每天也是在做着除妖的工作。
自从永远与刹那两人分开以来过了10年，穿越时代树时空的隧道再度开启。永远与出现在现代的刹那重逢，但刹那不知为何忘记了永远的事情。包括与刹那一同来到现代的诸叶在内，永远她们这些“半妖的夜叉姬”，开始在现代和战国时代掀起波澜！
