石蜡切片免疫组化实验是现代医学研究不可或缺的工具，融合了组织学、细胞学和免疫学，为深入了解疾病机制和提供精准诊断提供了强大支持。本文将探讨该实验的原理、关键步骤、和广泛应用。
简介
免疫组化（IHC）是一项分子生物学技术，通过应用具有高度特异性结合能力的抗原抗体及显色反应，以对组织细胞内的抗原进行精准定位、定性和相对定量的深入研究。该技术基于抗体与抗原的高度特异性结合机制，首先使得抗体与组织或细胞中的目标蛋白发生特异性结合，随后通过化学手段将抗体结合的位置可视化，从而实现对组织或细胞中未知抗原的定性、定位和定量研究。免疫组化在解剖学、病理学和生物医学研究领域发挥关键作用，为深入理解细胞和组织中分子水平的变化提供了强有力的工具。
应用范围
免疫组化在疾病诊断、生物学研究和药物开发中发挥关键作用。在临床应用方面，通过利用特定的肿瘤标志物，医生可以运用免疫组化技术来确诊肿瘤的良恶性，明确其分期和分级，并确定细胞类型和转移的源头，以便精准定位原发肿瘤。免疫组化在多种非肿瘤性疾病和病症的诊断中充当主要工具或确认程序的重要角色。
在科研领域中，免疫组化可独立应用，也可与其他分析技术结合，用于深入研究正常组织和器官的发育、病理过程、伤口愈合、细胞死亡和修复等多个领域。此外，免疫组化还在药物开发中扮演重要角色，通过检测靶组织和其他部位疾病标记物的活性、上调或下调，来评估药物的功效。
免疫组化检测的应用（图片来源于网络）
检测对象
该技术主要在处理组织标本方面发挥作用，涵盖了石蜡切片（包括病理切片和组织芯片）、冰冻切片以及漂片等多个应用。其中，石蜡切片是免疫组化中最为广泛和基础的一种应用，因为它能够保持组织形态的完整性，支持连续切片，有助于进行多指标染色的对照观察，并且能够长时间保存。
然而，在制作石蜡切片的过程中，蛋白质可能因为固定而发生相互交联，从而影响抗原抗体的结合。为了减轻这种影响，需要在免疫组化过程中进行抗原修复的步骤。这一步骤的目的是通过合适的方法，如热处理或酶解，解除蛋白质的交联，以提高抗体对抗原的特异性结合，确保准确且可靠的实验结果。
实验原理
实验原理根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。
免疫组化原理示意图（图片来源网络）
实验材料与仪器
材料：石蜡切、PBS、柠檬酸盐缓冲液、蒸馏水、增强剂、酶标抗鼠、兔聚合物、苏木素、酒精、二甲 苯、树胶、盐酸、二 氨 基 联 苯 胺。
仪器：烘箱、微波盒、塑料切片架、显微镜、胶头滴管。
实验步骤
1、石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。
2、石蜡切片首先被放置于67℃的烘箱中，经过2小时的烘片处理，使蜡质融化。然后，进行脱蜡处理，将切片放入含有pH=6.0柠檬酸盐缓冲液的容器中。随后，将容器放入微波盒中，通过微波加热至沸腾。将脱蜡水化后的组织切片放在耐高温塑料切片架上，再放入已沸腾的缓冲液中，使用中档微波处理10分钟。处理完成后，将微波盒取出，用流水自然冷却。从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，然后用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）进行2次3分钟的冲洗。（注），并非所有的抗体都需要进行微波修复，具体需根据实际情况而定。
3、每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3’。
4、除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
5、PBS冲洗3×5’。除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。PBS冲洗3×3’。
6、除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3×5’。
7、除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二 氨 基 联 苯 胺），显微镜下观察5分钟。
8、苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲 苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
实验流程图（图片来源网络） 实验流程图（图片来源网络）
注意事项
1、在对切片施加首次抗体后，第二次抗体与一抗结合，并标记上多聚螯合物酶（HRP）的复合物。多聚螯合物上携带有大量HRP分子，从而显著放大抗原信号。这一方法相比于SABC（streptavidin-biotin-peroxidase complex）和SP法，具有更高的敏感性。
2、因为多聚物在生物体内不存在，并且不使用生物素，因此成功避免了由生物素引起的非特异性背景染色。相对于SABC和SP法，这种方法的背景更为清晰。
3、辣根过氧化物酶与第二抗体结合在多聚物上，替代了传统的第二抗体和第三抗体的使用，显著减少了实验步骤。此外，试剂孵育时间仅需15分钟，使得免疫组化方法更为简便，相较于SABC和SP法，实验所需时间大大缩短。
案例展示
免疫组化应用于去分化脂肪肉瘤的鉴别诊断：
去分化脂肪肉瘤主要发生于腹膜后、腹腔和盆腔等部位，患者的生存率受到局部复发无法控制的影响而较低。去分化脂肪肉瘤被定义为从高分化脂肪肉瘤突然过渡到非脂肪性的肉瘤，其中非脂肪性成分呈现多样性形态，如梭形、上皮样、多形性等，间质黏液程度不一，大约10%的病例呈现异源性成分。若未采集到高分化脂肪肉瘤成分，则其形态学上并无特异性。非脂肪性成分可能在不同程度上表达SMA和desmin，从而容易与平滑肌肉瘤混淆。
然而，去分化脂肪肉瘤（以及高分化脂肪肉瘤）具备独特的分子遗传学变化，其中包括致癌基因MDM2和CDK4的高水平扩增。MDM2在去分化脂肪肉瘤中被确定为一个明确的诊断标志物。通过免疫组化检测MDM2过表达或FISH检测MDM2扩增均可用于鉴别诊断。在此过程中，免疫组化检测CDK4和MDM2的特异性较仅检测MDM2更强。
