看到这篇文章，小编再次感慨！临床意义本身，真是碾压一切的存在！来康康，中山大学的大佬们，如何通过几个样本，窜出一个大活（IF:39.3 Q/1）！2023年9月21日，中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授团队在Signal Transduction and Targeted Therapy IF:39.3 Q/1，发表了题为“Dynamic single-cell mapping unveils Epstein-Barr virus-imprinted T-cell exhaustion and on-treatment response[动态单细胞图谱揭示EB病毒介导T细胞耗竭以及免疫治疗反应的关键细胞亚群]”文章。研究团队通过针对6例患者动态单细胞转录组测序和配对的免疫组库（scTCR/BCR-seq），对免疫联合化疗前后EB病毒阳性和阴性胃癌的肿瘤免疫微环境进行了精细的解析。该研究成果揭示了胃癌患者治疗敏感性的免疫学基础，发现了免疫治疗反应的关键性T细胞亚群，为EBV阳性胃癌患者提供了新的治疗方向。
临床研究，发现问题，解决问题才是核心！测序和分析都是手段（小编啰嗦一句：测了一大堆，最后发现取样和研究目的不匹配，大忌！）；作者针对具体的问题，拨云见雾！从提出问题、评估意义、做出假设、验证假设，到最后的联合临床试验结果预测得到的结论的临床应用价值！
直接从机制延伸到临床应用层面！来看看大佬们到底干嘛了发现临床现象：
1、EBV相关胃癌 (EBVaGC)一般预后良好，并且具有更好的免疫治疗反应；
2、免疫治疗仅在约10%的胃癌（GC）有效，化疗联合免疫治疗具有更好的效果而作为GC患者的新标准一线治疗，但联合治疗只对一小部分GC患者效果较好；
梳理研究空白：
1、EBV感染是否影响免疫治疗疗效；
2、EBV感染影响免疫治疗效果的作用大小和潜在机制；
提出合理假设：
1、EBV感染会影响免疫治疗（联合化疗）的效果；
2、有望通过解析EBV相关胃癌免疫治疗（联合化疗）反应特征，获得预测临床反应的生物标志物；
3、针对EBV感染独有特征，靶向药物和免疫治疗联合使用，是否可以改善治疗效果；
一、背景胃癌（GC）是癌症相关死亡的主要因素，在过去十年中，免疫检查点抑制剂（ICI）的引入使各种类型癌症的治疗方法发生重大转变，然而PD-1/PD-L1通路阻断作为单一疗法的临床有效性仅在约10%的胃癌（GC）患者中观察到。化疗中联合抗PD-1/PD-L1治疗因为比单药治疗具有更好的效果，因此作为GC患者的新标准一线治疗，但只有一小部分GC患者联合治疗中获得持久的益处。因此，仍然迫切需要确定预测临床反应的生物标志物。EBV阳性似乎可以用来预测联合治疗的反应，目前正在评估中。
EBV（ ）GC是癌症基因组图谱（TCGA）研究网络确定的一个独特亚群。越来越多的数据，表明EBV（ ）GC中PD-1抑制剂的ORR为~25%，高于EBV（−）GC。尽管在理解EBV（ ）GC的临床特征方面取得重大进展，但关于病毒-宿主免疫相互作用及其独特特征的重要问题仍然存在。
根据最近的一项研究，有人提出EB病毒感染可以触发针对异常抗原的T细胞反应。对病原体的现有免疫力会影响身体对药物的反应，包括超敏反应的发展。要解EBV（ ）GC患者对免疫治疗的超敏反应，解所涉及的特定免疫反应至关重要。
在这项研究中，作者使用scRNA-seq和单细胞TCR/BCR测序技术表征免疫治疗联合化疗前后EBV（ ）和EBV（−）GC患者的动态肿瘤免疫结构。通过研究对免疫治疗联合化疗的耐药性和敏感性的潜在机制，发现对治疗有反应的特定免疫细胞亚型。
二、结果1、患者队列和研究设计为分析EBV（ ）GC和EBV（-）GC之间免疫微环境的差异，作者最初选择由6名GC患者组成的前瞻性训练队列（图1）。
为在免疫治疗联合化疗（抗PD-1 XELOX/FOLFOX）之前/之后获得单细胞转录组数据（图1）。对每个样本T细胞和B细胞进行单细胞V（D）J分析。
通过多重免疫组织化学（mIHC）染色分析定位原位肿瘤浸润免疫细胞;并在肝内胆管癌（ICC）队列中验证研究结果，该队列包括13例EBV（ ）ICC和19例EBV（−）ICC患者。
图1
2、晚期EBV（ ）GC和EBV（−）GC的独特单细胞免疫景观在进行主成分分析（PCA）或使用均匀流形近似和投影（UMAP）可视化数据之前，经过数据预处理和质量控制，作者将免疫细胞分为六大簇：T细胞、NK细胞、B细胞、浆细胞、髓系细胞和肥大细胞（图1）。
EBV（ ）GC和EBV（−）GC之间的比较显示，EBV（ ）GC具有炎性免疫表型，其中T细胞和B细胞浸润更多。EBV（−）GC显示免疫抑制肿瘤微环境（TME），浆细胞、髓系细胞和肥大细胞富集（Fig.1f ）。
在两组中，B细胞和浆细胞均显著增加，而髓系细胞在联合治疗后表现出减少，表明主要免疫细胞类型的动态变化。T细胞是与治疗反应相关的主要免疫细胞簇。通过检查所有T细胞中配对的TCRα和TCRβ库，在所有EBV（ ）GC患者中都检测到EBV特异性克隆扩增（图S1）,支持EBV（ ）GC中存在活跃的T细胞介导的免疫反应。
3、EBV印迹肿瘤内CD8 T细胞区鉴定T细胞是GC的主要细胞类型，在所有细胞类型中所占比例最高。T细胞的UMAP可视化鉴定28个亚群，进一步分析主要T细胞亚群的标记基因表达，T细胞相关功能基因的表达，包括naÏve标记、细胞因子和效应分子、共刺激分子、组织保留标记、衰竭标记和转录因子（图2a-c）
大多数CD8 T簇在EBV( )肿瘤中显示富集，表明这些细胞可能受到EBV感染的影响。进一步评估EBV( ) GC的动态变化显示，治疗后效应/细胞毒性CD8 T细胞和效应记忆/记忆CD8 T细胞的丰富度增加，其特征是共抑制分子的低表达和效应/细胞毒性或组织保留分子的高表达(图2c-d)。结果表明，这些细胞的克隆复活和重新激活可能是增强EBV( ) GC治疗反应的关键步骤。
为进一步解剖EBV相关的T细胞簇，分析EBV( )/EBV(−)和处理后/预处理后的扩增评分，扩增T细胞簇前5位分别为ZNF683 ITGA1 Tem、ZNF683 Tc、GZMK T、ZNF683 ITGAE Tem和循环T细胞(图2e)。
研究这些簇的功能(图2f和S2a-d)，发现EBV感染途径在GZMK T细胞中显著富集，为减少患者之间细胞分布不均匀造成的差异，定义Shannon多样性指数(SDI)来评估患者中每种细胞类型的同质性。通过计算SDI，发现GZMK T细胞的最高SDI表明该细胞簇均匀地存在于EBV( ) GC样品中(图S2e)。
将整个GZMK T细胞群重新聚为6个亚簇，有趣的是，仅在所有EBV( ) GC样本中鉴定出簇2;相比之下，其他五个簇在患者之间表现出很大的多样性(图2g-h和图S2f)。
进一步分析干扰素刺激基因在亚簇2 (ISG-15 CD8 T)中的表达明显更高(图S2g)；通路分析显示ISG-15 CD8 T细胞亚群中EBV相关免疫信号通路增加(图2i)；
作者在EBV( ) GC中发现一个清晰的ISG-15 CD8 T亚群(图S2h)，分析EBV( ) GC中主要的ISG-15 CD8 T亚群的基因signature，并在三个独立的队列中验证。EBV( ) GC样品中ISG-15 CD8 T显著富集(图2 j)。
这些数据表明EBV( ) GC在肿瘤浸润性T细胞中表现出更高的激活程序相对富集。
图2
图S2
4、高基线肿瘤内ISG-15 CD8型 T细胞表明免疫治疗联合化疗有益通过mIHC实验证实ISG-15 CD8 T细胞在其他EBV( ) GC中的存在(图3a)。进一步评估ISG-15 CD8 T细胞在其他EBV相关肿瘤中的作用，并通过mIHC证实ISG-15 CD8 T细胞在EBV( ) ICC中存在，而在EBV(-) ICC肿瘤中不存在(图3b；S2i)。
这些数据表明，ISG-15 CD8 T细胞并不局限于EBV( ) GC，而是在EBV相关癌症的TME形成中具有重要意义。
作者破译治疗后ISG-15 CD8 T细胞的动力学，与EBV(-) GC相比，免疫化疗后EBV( ) GC中ISG-15 CD8 T细胞的数量明显下降(图3c)。
ISG-15 CD8 T细胞的扩增评分与EBVDNA拷贝数水平呈正相关，这表明ISG-15 CD8 T细胞可能在针对肿瘤的免疫应答中具有重要功能(图3d)。
采用两个指标:治疗指数(Ti)和预测指数(Pi)探讨不同免疫细胞类型与临床反应之间的关系。对于Ti分析，ISG-15 CD8 T细胞具有显著的负Ti，这表明药物可能通过减少具有耗尽电位的ISG-15 CD8 T细胞而导致有效反应。相比之下，CXCL13 CD8 T细胞显示Ti阳性，表明CXCL13 CD8 T细胞可能作为抗肿瘤免疫的效应器发挥作用(图3e)。
基于Pi分析，作者发现TNFRSF9 Treg和ISG-15 CD8 T细胞成为有利治疗反应的最显著预测因子(图3f)。
研究通过scRNA-seq分析鉴定的这些ISG-15 CD8 T细胞特征是否可以作为治疗反应的预测因子，并使用接受免疫治疗的GC患者的bulk RNA-seq数据验证，发现ISG-15 CD8 T细胞特征与良好的治疗反应之间存在显著相关性(图3g)。
验证ISG-15 CD8 T细胞标记对其他免疫治疗队列治疗效果的预测意义，结果表明，ISG-15 CD8 T细胞特征可以区分黑色素瘤和尿路上皮癌队列中预后良好或不良的患者(图3h)。
使用基因表达数据来剖析T细胞的轨迹，ISG-15 CD8 T细胞位于三条重要通路的分叉处，分别通向CXCL13 CD8 T细胞、ZNF683 Tc细胞或GZMB Tc细胞(图3i)。
STARTRAC-tran分析显示，EBV( ) GC中ISG-15 CD8 T细胞与主动循环T细胞、CXCL13 CD8 T细胞和GZMB Tc细胞之间存在较强的相关性;在EBV(−)GC中，ISG-15 CD8 T细胞没有显示出与其他T细胞的密切关联(图S3a, b)。
在治疗后的EBV(−)肿瘤中未发现先前存在的ISG-15 CD8 T细胞的这种重新出现的克隆型(图3j)。
这些数据表明，ISG-15 CD8 T细胞作为中间前体耗竭T (Tpex)细胞，耗竭T (Tex)细胞和效应T细胞群体比例的波动与PD-1治疗反应有关。
图3
图S3
5、EBV（ ）GC的TME中B细胞反应的广泛上调鉴定14,706个B细胞的16个亚群，包括5个CD19 B细胞亚群和11个浆细胞亚群(图4a,b)。与EBV(−)GC相比，EBV( ) GC癌表现出更高的浆细胞水平。评估B细胞簇中的Ti和Pi参数时，没有发现一致的EBV相关细胞群(图4c)。细胞间相互作用表明，EBV( ) GC中的B细胞与各种细胞进行广泛的通信(图S3c)。
通过BCR储备数据集，发现免疫球蛋白重链和轻链的克隆计数数量更高，并且与EBV(−)GC相比，EBV( ) GC中BCR的多样性增加，表明B细胞介导的反应强劲(图4d)。
通过mIHC检测B细胞在蛋白质水平上的空间分布，并观察到大量CD19 B细胞定位于EBV( ) GC肿瘤的三级淋巴样结构(TLS)中，这些肿瘤与CD4 和CD8 T细胞共定位(图4e)。
接近性分析显示，CD8 T细胞与CD19 B细胞的位置非常接近，表明B-T细胞可能存在相互作用。
EBV( ) GC患者的肿瘤表现出B细胞特征和生发中心特征的显著富集(图4f和g)。
总体而言，这些发现表明EBV( ) GC的TME中B细胞反应广泛上调，TLSs的富集可能部分解释EBV( ) GC肿瘤中更好的免疫治疗效果。
图4
6、EBV（ ）GC中髓系细胞和T细胞之间的密切相互作用髓系细胞表现出显著的异质性，并聚集成11个独立的亚群，包括巨噬细胞、单核细胞、浆细胞样树突状细胞(pDCs)、常规树突状细胞(cdc)和肥大细胞(图S4a),根据典型标记物的表达及其组织来源对这些簇进行注释(图S4b)。
与EBV(−)GC相比，EBV( ) GC中这些肿瘤相关巨噬细胞(tam)的丰度较低(图S4c)。
探究髓细胞和其他细胞之间的相互作用，发现EBV( ) GC中髓细胞介导的免疫反应比EBV(-) GC少。在EBV( ) GC和EBV(−)GC中，髓系细胞和T细胞之间的密切相互作用都被注意到。髓系细胞可能以直接和间接的方式调节T细胞的反应。
图S4
7、抗LAG-3阻断可有效治疗难治性EBV（ ）GC观察到EBV( ) GC中功能失调的CD8 T细胞中免疫检查点分子的显著上调,有趣的是，LAG-3是EBV( ) GC中表达最显著的衰竭标志物。动力学分析显示，在ICI治疗后，功能失调的CD8 T细胞仍然具有显著的LAG-3高表达(图5a和图S5a, b)。
评估EBV( ) GC中LAG-3信号传导的典型配体，在所有三个EBV( ) GC队列中发现高度激活的主要组织相容性复合体II类(MHC-II)特征(图S6a);在EBV( ) GC和EBV(−)GC之间，FGL1、SNCA、LGALS3和CLEC4G的表达相似(图S6b)。
使用来自GC队列的scRNA数据，发现专业抗原呈递细胞(DC,B细胞和巨噬细胞)表现出MHC-II特征的表达升高。与EBV(−)GC样品相比，EBV( ) GC样品中大多数B细胞簇、pDC、cDC和NLRP3 髓系细胞中MHC-II特征的表达明显更高。
为研究MHC-II在LAG-3激活中的作用，通过EBV( ) GC的bulkRNA-seq组和单细胞RNA-seq数据集进行细胞相互作用分析，筛选LAG-3配体(FGL1、SNCA、LGALS3、CLEC4G和MHC-II)，MHC-II和LGALS3显示出细胞间相互作用的可能性。进一步计算B细胞、髓系细胞和T细胞之间相互作用的可能性。发现在EBV( ) GC患者中，MHC-II分子(HLA-DRA、HLA-DQA1和HLA-DPA1)与LAG-3的相互作用评分远高于LGALS3。
总体而言，APC中MHC-II途径的增强协调表达可能在LAG-3在EBV( ) GC中的抑制作用中发挥作用。
mIHC分析表明与EBV(-) GC相比，EBV( ) GC中总CD8 T细胞中LAG-3 CD8 T细胞的比例更高(图5b)；EBV( ) ICC中LAG-3 CD8 T细胞的丰度更高，表明这些细胞在EBV( )环境中富集(图5c)。
基于的研究结果，LAG-3可能是EBV( ) GC免疫治疗靶向的一个有希望的候选者。
为进一步解T细胞耗竭的途径，将基因表达数据与发育轨迹结合起来，随着LAG-3水平的增加，ISG-15 CD8 T细胞群是T细胞衰竭的关键转折点(图5d，5e)。
此外，LAG-3的表达相对高于其他免疫检查点(CTLA-4、TIGIT和PDCD1)(S9a-c)。
EBV( ) NPC的背景下，对CD8 T细胞的分析揭示ISG-15 CD8 T细胞的独特分化程序，其分化模式与naïve CD8 T细胞向细胞毒性CD8 T细胞的转变相似。这些ISG-15 CD8 T细胞也显示出LAG-3的表达升高。
EBV( )肿瘤中LAG-3的上调是EBV相关激活触发的耗尽表达程序的结果，表明了LAG-3作为针对EBV( )肿瘤治疗策略的有前途的检查点分子的潜在重要性。
图S5
图S6
图S7
图S8
图S9
图S10
图5
在临床试验中，观察到一位标准治疗，包括二线化疗，均失败的转移性GC患者，他参与了1b期临床试验，评估MGD013(靶向PD-1和LAG-3的双抗)联合尼拉帕尼治疗效果并出现了部分反应(图6a)；
有趣的事，该患者有EBV( ) ，并且MGD013治疗前肿瘤中LAG-3 GZMK CD8 T细胞的富集(图6b)；患者在联合治疗3个月后初步达到SD；在MGD013单药治疗1个月后达到PR;最终于2022年4月进展，无进展生存期为9.5个月(图6c)。
另一名EBV( )型胃癌患者加入了KL-A289 (LAG-3抑制剂)的1期临床试验；该患者包括TIGIT抑制剂联合PD-1抑制剂的临床试验在内的既往治疗均失败(图6d)。值得注意的是，该患者治疗前肿瘤显示出LAG-3 GZMK CD8 T细胞的显著浸润(图6e)。经过2个周期的KL-A289治疗后，患者达到SD(图6f)，并且EBV-DNA拷贝数也有显著的下降(图6g)。
图6
三、结论EBV ( ) GC代表了一种独特的GC亚群，它能从新抗原中产生强大的炎症反应大多数GCs在免疫上是“冷的”。相比之下，EBV( )肿瘤被特异性和功能尚不清楚。在这里，作者将全面的单细胞转录组与bulk RNA-seq数据结合起来，以确定EBV ( ) GC背后的免疫细胞组成和效应程序的变化。观察到与EBV(−)GC相比，EBV ( ) GC中T和B淋巴细胞的显著积累。TCR和BCR库分析揭示了扩增的肿瘤内克隆类型的表型，并显示EBV ( ) GC中活性T/B细胞与抗肿瘤免疫相关，使EBV ( ) GC对化疗联合免疫检查点抑制剂更敏感。
四、思路扩展其实最简单的思路，原文已经点名来！有木有！EBV相关的几种肿瘤，都具有免疫治疗更加敏感的特征，并且由相同的T细胞亚群介导！
1、运用同样的思路，解析其他EBV相关肿瘤免疫治疗相关机制！（点到为止！不可剧透。。。。）
2、“相同的T细胞亚群”单独拿出来，不管是研究其他几种肿瘤，还是小泛癌，都可以上传统分析，预测预后、治疗效果、构建模型等等；可以是转录组，也可以联合单细胞，可大可小！基本上3-5分没有问题！
其他类型的病原微生物分析！思路稍微打开一些！EBV可以！那HPV是不是也可以！HP是不是也可以！HBV,HCV就更可以了！总之花样繁多，公开数据挖掘一下，总会有惊喜！l肿瘤可以，那疾病有何不可？随机点名几个病原微生物相关疾病！病毒性肝炎肝纤维化、幽门螺杆菌相关胃炎。。。。。综上！上升期的医生群体最适合做这一类的临床研究，和基础医学的同行相比，更具有天然优势！临床研究，只要研究目的明确，临床意义清晰！最最最容易忽略的是——取样合理！将一个问题，由因到果描述清楚！足以！
