上游种子制备工艺是生物制剂生产的准备环节，对其进行优化可改进生产效率、提高生产力以及降低生产成本。然而，现有的上游设备和/或基础设施会制约工艺强化而限制效率改进，能达到的最高种子细胞密度也限定了补料分批生产生物反应器能达到的最高生产力。有一种策略可以提高现有补料分批生产生物反应器的产量，即在N-1生物反应器中采用灌流技术提高种子制备的最终生物质含量，使补料分批生产生物反应器能够接种的细胞密度远超传统补料分批制备工艺，以下是一些有用的参考资料，可以帮助你更好地了解：www.sigmaaldrich.cn
本应用说明描述了Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基的优势和性能，这款培养基专门开发用于从细胞复苏到N-1阶段的多个种子细胞扩增步骤，以产生更多生物质接种补料分批生产生物反应器。文中出示4种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株在该扩增培养基中生长的倍增时间、活力和活细胞密度数据，证明该现货即用型产品在这一应用的可行性。 从该培养基转向我们生产阶段的某种培养基平台时，也无需驯化细胞或确认相容性。
图 1.标准生产工艺与N-1灌流式种子制备工艺的比较
N-1灌流培养和N-1专用扩增培养基的优势
种子制备（seed train，种子扩大培养）是放大培养细胞得到足够的细胞密度以便接种生产生物反应器的必需环节。一直以来，种子制备严重依赖分批或补料分批工艺，其中细胞随着几次体积扩大过程而增殖积累，然后用于接种生产生物反应器。这些工艺方法由于培养容器容量较小，以及传统补料策略提供的营养有限使细胞生长受限，导致最终能达到的种子密度也相对有限。 在N-1步骤采取灌流培养和专用的Cellvento® 4CHO-X扩增培养基，可积累更多的生物质，从而让补料分批生产生物反应器能够接种的细胞密度达到传统N-1步骤的5-15倍（图1）。这里比较重要的一点是，应采用仍然处于指数生长期的细胞接种N阶段的最终生物反应器。
Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基专门用于CHO细胞系的种子扩增和N-1灌流培养，支持细胞在N-1生物反应器的高密度和高活力生长，最终提高用于生产生物反应器接种的细胞生物质含量（图2）。这款扩增培养基以最优的营养物质浓度比例配制而成，可实现高细胞密度下的低细胞比灌流速率(CSPR)。培养基化学成分确定、无动物源成分，且不含任何水解产物或未知成分或多变组分。培养基经过特别调配以控制细胞在灌流操作模式下的代谢表现，既能尽量减少抑制性副产物，又能保证充足的营养水平以支持高密度细胞培养。
图 2.(A)某生物反应器接种0.5 x 106个活细胞/mL密度的CHOZN® GS细胞株，并以分批培养模式在Cellvento® 4CHO-X扩增培养基中生长约3天。之后，改用添加葡萄糖的Cellvento® 4CHO-X扩增培养基开始灌流培养（灌流速率vvd-1）。(B) 活细胞密度(VCD)的对数图表明N-1灌流生物反应器中的细胞维持在指数生长期。
CELLVENTO® 4CHO-X细胞扩增培养基的性能
本研究采用常用的CHO细胞亚型（CHO-GS、CHO-K1-GS和CHO DG44） 证明Cellvento® 4CHO-X扩增培养基具有广泛的应用性。细胞株先在Cellvento® 4CHO-X扩增培养基中培养，然后以300,000细胞/mL密度接种30 mL工作体积到TPP离心管中。离心管放到37 °C振荡培养箱中培养，设5% CO2，80%湿度，25 mm振幅，320 rpm转速。细胞培养3或4天后进行传代。
图3显示CHOZN® GS-/-克隆（CHOZN-GS 1和CHOZN-GS 2）与其他两种常用生产细胞株（CHO-K1-GS和CHO DG44）在Cellvento® 4CHO-X扩增培养基中生长第4天的倍增时间(A)，第4天活力(B)和活细胞密度(C)。在培养第4天，所有4种细胞株都显示一致的倍增时间、活力和活细胞密度。表1显示同一细胞株在第3和第4天的倍增时间没有显著差别。
图 3.4种CHO细胞亚型在Cellvento® 4CHO-X扩增培养基中生长的(A)第4天倍增时间，(B)第4天活力和(C)第4天活细胞密度。
表1.各种CHO亚型细胞在Cellvento® 4CHO-X细胞扩增培养基中的生长特性。
