四十年的草酸草酸杆菌，胆小的草酸盐降解专家

Daniel SL, Moradi L, Paiste H, Wood KD, Assimos DG, Holmes RP, Nazzal L, Hatch M, Knight J. Forty Years of Oxalobacter formigenes, a Gutsy Oxalate-Degrading Specialist. Appl Environ Microbiol. 2021 Aug 26;87(18):e0054421. doi: 10.1128/AEM.00544-21. Epub 2021 Aug 26. PMID: 34190610; PMCID: PMC8388816.

草酸杆菌是一种独特的厌氧细菌，仅依靠草酸盐生长，是哺乳动物肠道中关键的草酸降解细菌。O. formigenes在肠道中降解草酸盐在预防以富含草酸盐的植物为食的动物的肾毒性方面起着关键作用。O. formigenes在降低人类草酸钙肾结石病和草酸盐肾病风险中的作用不太清楚，部分原因是培养这种生物体的困难以及缺乏利用控制草酸盐含量的饮食的研究。本文回顾了O. formigenes发现40周年的文献，重点是其生物学，其在肠道草酸盐代谢和草酸钙肾结石疾病中的作用，以及未来潜在的研究领域。还讨论了在健康志愿者和原发性高草酸尿症 1 型 （PH1）（一种罕见但严重的草酸钙肾结石病）患者中使用产氧O. formigenes的临床试验的结果。关于O. formigenes菌株和培养这种细菌的最佳实践的信息已经整合，这应该作为研究人员的良好资源。

1940年代和1950年代的研究表明，草酸盐被人类粪便和瘤胃中的微生物降解，尽管对负责这种活动的微生物的性质知之甚少（1，2）。草酸盐是一种常见于人类食用的植物（例如大黄、菠菜和甜菜）和反刍动物食用的各种饲料植物（例如，卤素）中的化合物 （3）。当大量摄入草酸盐时，草酸钙晶体在肾脏中的形成和沉积可发生肾毒性（无花果。1一).当绵羊在富含草酸盐的植物（无花果。1乙) (4）. 虽然钙补充剂用于减少放牧动物的急性草酸盐毒性（5），但最成功的方法是逐渐适应高草酸盐摄入量（6）。另据报道，季节性饮食模式影响这些动物瘤胃中细菌对草酸盐的降解，并且在富含草酸盐的植物以放牧作物为主的季节降解最高（7）。最初的假设是，草酸盐降解生物在富含草酸盐的植物上共生，并在牲畜吃草时被摄入（7），但这后来被Allison及其同事拒绝，他们证明选择常驻草酸盐降解细菌，而不是引入新物种，是瘤胃中草酸盐降解速率和草酸盐降解细菌数量增加的原因（8， 9）. 考虑到瘤胃的严格厌氧条件，Allison及其同事假设严格的厌氧菌是导致大部分瘤胃草酸盐降解的原因，1980年，Karl Dawson从绵羊瘤胃中分离出一种厌氧草酸盐降解细菌 (10）. 1985年，米尔顿·艾利森及其同事从人类粪便中分离出同样的细菌），并命名为甲酸草酸杆菌（11）。重要的是，这是首次在人类肠道中发现一种完全依赖草酸盐的共生专性厌氧菌。因此，与可以使用各种底物（包括草酸盐）的“通才”相比，这种有益的肠道细菌在草酸盐利用方面被认为是“专家”。自分离以来，许多研究已经检查了O. formigenes定植对肠道草酸盐水平，尿草酸盐排泄和草酸盐在哺乳动物肠道中运输的影响。

图1

（A）草酸盐喂养的实验室大鼠的染色肾组织薄切片中的草酸盐晶体（箭头表示存在的一些晶体）（R. C. Cutlip和S. L. Daniel，未发表的数据）。（B） 死羊（>1，200），由于食用高含草酸盐的植物卤素而中毒（转载自参考文献101）。

图2

Karl A. Dawson（A）和Milton J. Allison（B）是负责分离和命名草酸盐降解肠道细菌Oxalobacter formigenes的两位微生物学家。道森博士（奥特奇副总裁兼首席科学官，现已退休）在30年奥特奇第2014届年度国际研讨会上发表演讲。2018年，艾利森博士在他位于爱荷华州立大学的实验室里。

产果菌是一种革兰氏阴性、专性厌氧、杆状或曲线状、非运动、非孢子形成细菌（无花果。3），已分配给以下分类群：细菌（域）;变形杆菌（门）;β变形杆菌（类）;伯克霍尔迪亚莱斯（订单）;草酸杆菌科（科）;草酸杆菌（属）;甲虫（种）;和 OxB（类型菌株）。表1列出了迄今为止分离出的各种O. formigene菌株的详细信息。比较17种产果菌菌株的细胞脂肪酸谱，包括从人类，绵羊，牛，猪，豚鼠和大鼠（野生和实验室）以及淡水湖沉积物的胃肠道内容物中分离的菌株，支持将这些菌株分为两大类（目前指定为I组和II组）的概念。在I组菌株中，环状17-碳脂肪酸占主导地位，而在II组中，环状19-碳脂肪酸占主导地位（11，15）。此外，基于细胞脂肪酸将菌株分成两组得到了基于细胞蛋白、血清学检测、16S rRNA 序列以及针对oxc基因的寡核苷酸探针/引物的特异性观察到的差异谱图的良好支持（11、15、–17).迄今为止，唯一的例外似乎是菌株OxGP1（从豚鼠盲肠中分离出来），根据细胞脂肪酸和oxc基因分析，它属于II组，当基于rRNA序列比较时，它属于I组（无花果。4) (16）. 有趣的是，另一种菌株 HOxBLS（II 组成员）在基于 16S rRNA 的系统发育树中介于 I 组和 II 组之间（无花果。4).总体而言，II组菌株似乎比I组菌株更多样化，因此Sidhu等人建议II组菌株可以进一步分为3个亚组（17）。这种菌株的分组/亚组相对于O. formigene及其生态学，营养和生理学，抗生素敏感性，人类定植以及对尿草酸盐和肾结石预防的影响（仅举几例）意味着什么目前尚不清楚，需要进一步研究。值得注意的是，II组菌株通常更难在肉汤培养物中维持，并且不能达到与I组菌株相同的最终光学密度（未发表的观察结果）。因此，在使用II组菌株时，应提供充足的冷冻甘油储备液用于培养物回收。

图3（A）甲酸草酸杆菌菌株OxWR1的电子显微照片（转载自参考文献102）。（B）甲酸草酸杆菌菌株HOxBLS的革兰染色（N. Pareek和S. L. Daniel，未发表的数据;×1，000放大倍数）具有典型的不同形态和大小。

图4

基于从国家生物技术信息中心 （NCBI） 获得的 67S rRNA 序列，对甲酸草酸杆菌 I 组和 II 组菌株和血清螺旋菌菌株 Z16（外组和Beta 变形杆菌类的成员）进行系统发育分析。GenBank的入藏号与菌株名称一起显示。进化历史和距离分别使用邻接法（103）和最大复合似然法（104）计算。引导值以 1，000 次重复的百分比表示，显示在树中的每个内部节点旁边 （105）。比例尺表示每个碱基的替换数的估计值。进化分析在分子进化遗传学分析（MEGA）中进行（106）。

培养物中产果菌的最佳生长发生在pH值在6至7之间的厌氧条件下，并且在CO中2-含有矿物质、草酸盐、乙酸盐和少量酵母提取物（表2).酵母提取物虽然不是必需的，但似乎确实可以改善某些O. formigenes菌株的生长，特别是在最初从肠道中分离出来时。然而，无论酵母提取物的存在与否，都会添加低浓度（0.5至2mM）的乙酸盐，因为O. formigenes从乙酸盐和二氧化碳中吸收少量碳，用于合成细胞生物质（无花果。5).单独的乙酸盐不支持这种生物体的生长;事实上，迄今为止测试的60多种不同化合物中没有一种被发现支持O的生长。甲醛（11，18，19）。即使是富集的复合培养基（例如，厌氧蛋白胨酵母葡萄糖或脑心脏输注）也不能支持产氧O.的生长，因此经常接种以帮助确定O. formigene培养物的纯度（18）。

图5

产草酸草酸杆菌代谢示意图。

表2

厌氧草酸盐肉汤，用于产草酸草酸杆菌的富集和常规培养

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一个按上述顺序将组分添加到锥形瓶中;如果需要确定的培养基，则可以省略酵母提取物。为了安全起见，烧瓶的体积应为所制备培养基量的两倍。总体积大于 1 升，以解释煮沸过程中损失的水。

b将pH调节至7，加入碳酸氢钠（每升7.5克），并在加热板上煮沸培养基，同时冒泡一氧化碳2.培养基中的刃天青（O / R指示剂）从蓝色变为粉红色（约5至10分钟沸腾）后，使用高压釜手套小心地将烧瓶从热量上移开，并继续用CO起泡2并在冰浴中将培养基冷却至室温。加入还原剂半胱氨酸·盐酸·H2O（每升 0.5 克），混合并冲洗顶部空间与一氧化碳2直到培养基还原（无色）。将 10 ml 等分试样分配到培养管（18 x 150 mm;系列 2048 [Bellco 玻璃];∼27.2 ml 塞子体积）中，用温和的 CO 流冲洗2.用一氧化碳齐平顶部空间25秒，然后用灰色丁基橡胶塞，用铝压接密封件密封。在密封管子时，在添加介质之前，应将气管放入下一个空管中进行冲洗。逐管重复处理，直到分配整个培养基。在 121°C 下高压灭菌 15 分钟并快速排气。高压灭菌后，培养基的pH值为6.6至6.8。

c矿物溶液含有（克/升）：KCl，20;新罕布什尔州4氯，10;韩2采购订单4, 10;和镁硫磺酸4·7H2O，1（一次溶解一个并将溶液储存在4°C）。

d微量金属溶液含有（克/升）：次氮基三乙酸三钠，1.500;锰硫4·H2O， 0.500;二氧化铁4·7H2O， 0.100;CO（否）3)2·6H2O， 0.100;氯化锌2, 0.100;氯化镍2·6H2O， 0.050;H2筝尾3,0.050;铜酸4·5H2O， 0.010;AlK（SO4)2·12H2O， 0.010;H3博3, 0.010;那2哞4·2H2O， 0.010;和娜2窝4·2H2O，0.010（一次溶解一个并将溶液储存在4°C）。

O. formigenes的标志性特征之一是它绝对需要草酸盐作为产生能量的基质和生长的主要碳来源（无花果。5) (20，-22）。鉴于草酸盐的高度氧化状态，能量产量很低，但足以支持生长。草酸盐代谢的产物是二氧化碳和甲酸盐，每摩尔草酸盐代谢产生约1mol。能量守恒的核心是通过草酸盐（in）和甲酸盐（out）在细胞膜上的电源交换来发展质子动力，以及当草酸的CoA酯被草酰辅酶A脱羧时细胞内质子的消耗（23，24）。质子消耗最终导致外部环境的碱化。

大多数（如果不是全部）列出的菌株表1使用Hungate开发的厌氧辊管技术（25，–27）和培养基（表2）由道森和其他人在1980年代从绵羊瘤胃中分离出O. formigenes菌株OxB后开发（10）。一种这样的新方法是使用含有草酸钙的厌氧卷管，其中可以根据菌落周围形成透明区域（ 无花果。6;看表3用于制备厌氧草酸钙卷管和板）。多年来，这种方法已成功用于从肠道和环境样品中分离（有或没有事先富集），计数和表征O. formigenes菌株16，28）。

图6

在厌氧辊管（A和B）和含有草酸钙的厌氧板（C）中孵育后，甲酸草酸草酸杆菌在菌落周围形成的透明区域。看表3用于在管和平板中制备厌氧草酸钙琼脂。

表3

厌氧草酸钙琼脂用于产甲烷草酸杆菌的计数和分离

一个按照指示的顺序将上述所有组分加入带有搅拌棒的2升锥形瓶中;为了安全起见，烧瓶的体积应为所制备培养基量的两倍。

b厌氧辊管（无花果。6）：搅拌混合，在加热板上煮沸，同时用一氧化碳冒泡2.继续煮沸培养基，直到琼脂融化。琼脂融化后，继续用一氧化碳鼓泡培养基2并使用高压釜手套小心地将烧瓶从热量上移开，将烧瓶转移到装有热水（∼50°C）的绝缘桶中。热水桶应放在一个小搅拌板上，以便在分配时可以搅拌介质。分配时保持草酸钙悬浮很重要。搅拌并继续用一氧化碳使培养基起泡2并让培养基冷却约5分钟。将 7 ml 分配到 18 × 150 mm 压接密封培养管中，该培养管正在用 CO 冲洗2按照中所述的过程进行操作表2.在 121°C 下高压灭菌 15 分钟并快速排气。高压灭菌后，培养基pH值为6.6至6.8。如果当天使用该培养基，请将试管放入水浴（∼48°C）中回火。回火后，通过无菌针头和注射器将样品（接种物）添加到试管中;接种后，通过倒置试管数次将接种物轻轻混合到培养基中，然后将试管侧放在冰上（包含在不加水的冰桶中）并快速旋转管，使琼脂凝固在管的内壁上。如果当天不使用琼脂培养基，请将培养基储存在室温下，并在需要时重新加热以融化琼脂。一旦接种的试管被放入培养箱中，冷凝（水）将积聚在管的底部。保持接种的卷管直立，以防止底部的水污染菌落。

c厌氧板（无花果。6）：使用与上述相同的组分，但进行以下修改：在500升烧瓶中制备1ml培养基;碳酸氢钠和一氧化碳2在准备中被省略;在高压灭菌前将培养基的pH值调节至6.6至6.8;高压灭菌后，将回火琼脂培养基（∼20ml;如果平板含有一层薄薄的琼脂培养基，则更容易检测透明区域）倒入实验室工作台上的无菌培养皿中，琼脂凝固后，将平板转移到厌氧室（90%N2/5% 一氧化碳2/5% H2），并在使用前脱气过夜（例如条纹）并在腔室中孵育。

这种细菌的独特特征可能因菌株而异，可能会影响其配制成益生菌制剂的能力。最近的一项研究检查了与益生菌菌株制造相关的一些常见过程和条件，强调了I组O.甲虫菌株OxCC13对酸奶冻干和储存的弹性（29）。也许人类可能能够以冻干形式与有利的菌株定植或混合在酸奶中。

O. formigenes的基因组（13，30，-32）和蛋白质组（33）的可用性为我们增加了对这种有益肠道细菌的重要生物学特性的理解提供了机会，包括鉴定重要的蛋白质和途径，这些蛋白质和途径促进定植恢复力，空气耐受性和宿主来源的草酸盐的肠道分泌。对两种O. formigenes菌株的基因组序列的回顾发现了一些有趣的差异，这些差异可能表明I组和II组菌株利用不同的途径在肠道内存活和繁殖（13）。

O. formigenes基因组的一般特征显示在表4.目前，只有4种培养的产菌O. formigenes菌株（I组菌株HC-1和OxCC13，推定的I组菌株SYGSS-15和II组菌株HOxBLS）具有公开可用的测序基因组（13，30，-32）。相比之下，分别有超过50个和500个测序基因组来自常驻肠道厌氧菌Phocaeicola vulgatus（Bacteroides vulgatus）和胃病原体幽门螺杆菌的培养菌株。尽管数据集有限，但很明显，O. formigenesHC-1和HOxBLS的基因组（表4），以及 OxCC13 （31） 和 SYGSS-15 （30） 报告的那些都很小，大小为 ∼2.5 Mb。相比之下，大肠杆菌Nissle 1917的基因组，一种经过充分研究的革兰氏阴性益生菌肠道细菌（商业销售为Mutaflor），为∼5.4Mb（34，35）。 原核基因组大小范围从0.5到超过10 Mb，表明O. formigenes基因组更倾向于基因组大小尺度的下端（较小）。Gao等人最近报道，CRISPR系统和与原核生物基因组相关的病毒（噬菌体）的组合似乎阻碍了基因组扩增，因此随着时间的推移会导致基因组尺寸变小（36）。鉴于CRISPR计数和在该生物体基因组中观察到的大量噬菌体编码元件（表4).

表4

产草酸草酸杆菌菌株的基因组特征一个

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一个联合基因组研究所（JGI）/综合微生物基因组和微生物组（IMG/M）（107）、国家生物技术信息中心（NCBI）网站和PHASTER（116）网站的数据和资源被用于编制该数据集。大肠杆菌Nissle 1917 被包括在内以进行比较 （34）。

b组名称来自Jensen和Allison（15）。

cORF，打开阅读框架。该值表示噬菌体和细菌蛋白质数据库中匹配的蛋白质数量，这些蛋白质在PHASTR完整性评分标准评分为“完整”的区域。O.甲虫HC-1，O.甲醛HOxBLS和大肠杆菌Nissle 1917分别包含3个（3个），3个（4个）和1个（5个）完整的噬菌体区域。括号值包括所有噬菌体区域中噬菌体和细菌蛋白数据库中的匹配项，评分为完整、不完整和可疑。

O. formigenes基因组的其他特征在无花果。7.O. formigenes菌株HC-1和HOxBLS之间的基因谱（例如，Pfam，COG，KEGG Orthology，TIGRfam，酶，KEGG途径，MetaCyc途径，跨膜蛋白，信号肽蛋白和IMG途径）非常相似。一些值得注意的例外是HOxBLS（II组菌株）属于具有功能预测的蛋白质编码基因类别，其中基因数量（%）减少，或者在生物合成簇中的蛋白质编码基因类别中，其中基因完全不存在。后者继续建立在II组菌株相对于体外生长的稳健性降低的潜在原因之上。有趣的是，在融合蛋白编码基因类别中，O. formigenesHC-1和HOxBLS基因数量（%）实际上高于大肠杆菌Nissle 7（7.10%）（无花果。7).基因融合（也称为“复合基因”）是在生物体中创建新基因的机制之一，包括原核生物，其平均含有14.5%的复合基因（37，38）。基因融合，以及CRISPR系统和噬菌体编码元件，如何共同帮助塑造O的基因组和进化历史。福米基因，正在等待被阐明。

图7

甲酸草酸杆菌菌株的基因组特征和组成。联合基因组研究所（JGI）/综合微生物基因组（IMG）（107）和国家生物技术信息中心（NCBI）网站的数据和资源被用于编制该数据集。大肠杆菌Nissle 1917 （34） 被包括在内以进行比较。

直系同源基因簇（COGs）是一种多功能工具，多年来一直用于细菌和古菌（39，40）测序基因组的注释和比较分析。COG由直系同源蛋白编码基因家族组成，可以归入26个功能类别中的一个或多个。这允许对生物体相对于其代谢，细胞处理和信号传导，信息存储和处理以及表征不良的蛋白质进行详细比较。在以下COG功能类别中，甲虫HC-0和HOxBLS在基因分布方面存在微小差异（5.1至0.1%）：J，翻译，核糖体结构和生物发生;P、无机离子转运代谢;L、复制、*和修复;C、能源的产生和转换;和X，移动组：噬菌体，转座子（无花果。8).菌株之间差异的一个例子是，I组菌株HC-118和OxCC1之间共享13个COG，而II组菌株HOxBLS中不存在这些相同的118个COG。同样，HOxBLS有70个独特的COG。在O. formigenes菌株和大肠杆菌Nissle 1之间分配给COG类别的基因中可以看到更大的差异（3%至1917%），其中“碳水化合物运输和代谢”类别（G类）的差异最大。在大肠杆菌Nissle 1917中，约11%的具有COG的蛋白质编码基因与此功能类别相关，而O. formigenes菌株中的∼4%与该功能类别相关（无花果。8).考虑到O. formigenes作为草酸盐代谢专家的性质，这似乎是合理的，它无法利用其他底物，包括碳水化合物，作为能量来源。

图8

Oxalobacter formigenici-1、Oxalobacter formigenegenesHOxBLS 和Escherichia coliNissle 1917 直系同源基因 （COG） 类别中基因簇中的分布和丰度。大肠杆菌Nissle 1917 （34） 被包括在内以进行比较。联合基因组研究所（JGI）/综合微生物基因组（IMG）网站（107）的数据和资源用于编制该数据集。对于O. formigenesHC-1，O. formigenesHOxBLS和E. coliNissle 1917，分别有746，737和1291个基因不在COG中。

基于质谱的霰弹枪法蛋白质组学鉴定了I组O.甲虫菌株OxCC1中822，1个独特蛋白质编码基因中的867，13种蛋白质（33）。从所提供的蛋白质数据集来看，很明显，这种生物体包含一系列代谢途径，这些途径介导营养变化和环境压力的适应。例如，蛋白质组学分析显示，相对于对数期，固定相的超氧化物歧化酶增加，表明O. formigenes具有在大肠厌氧环境之外持续存在的能力。

最近的研究集中在O. formigenes是否表达其代谢组中的特征，这些特征在其他草酸盐降解细菌（中是独特的和/或检测不到的41，42）。这些有趣的研究揭示了与嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌和动物双歧杆菌的裂解物制剂相比，产果霉菌株HC-12裂解物制剂的一组1个独家特征（41）。关于产氧O. formigenes菌株HC-1和OxWR的代谢组和脂质组的差异，尽管发现代谢组和脂质组在两种菌株之间基本保守（42）。未来的研究需要“扩大草酸杆菌属的确定代谢组和脂质组”。（42）. 例如，此类研究可能导致鉴定可以增强肠道草酸盐分泌和定植恢复力的特定分子。

人类中O. formigenes定植的患病率和丰度已被几项研究调查。然而，缺乏标准化的产菌检测方法（基于培养物与分子检测）以及生物体丰度低使得准确评估定植具有挑战性。O. formigenes定植频率因不同种群而异。印度北部的一项研究表明，65%的健康成年人存在O. formigenes定植（43）。韩国首尔一项针对健康成年人的研究表明，79%的个体（197人中的233人）存在oxc基因（O. formigenes的标志物）（44）。在健康的日本参与者中，80名男性受试者中有54%和62名女性受试者中有34%显示出O. formigenes的定植（45）。在健康美国成年人的两个大型队列研究中，∼30%定植与O. formigenes（46，47）。 这比其他国家要低得多。PeBenito等人研究了3个不同人群的O. formigenes定植，发现与坦桑尼亚的Hadza人或委内瑞拉的美洲印第安人相比，美国队列中的O. formigenes定植率要低得多（48）。Clemente等人研究了与西方医学或文化没有接触的Yanomami村庄成员的O. formigenes定植，并且还发现与美国相比，O. formigenes定植率要高得多（49）。Clemente等人进一步分层抗生素的使用，发现西化显着影响O. formigenes定植，独立于抗生素暴露。这些数据表明，我们的现代生活方式有助于有益微生物群的消失（50）。事实上，在检测到O. formigenes的粪便样本中，肠道微生物群更加多样化，全球微生物网络显示出更多的连通性和对模拟干扰的弹性。这表明O. formigenes的患病率和丰度是肠道微生物组生态状态的指标（51）。

来自人类微生物组项目（HMP）和美国肠道项目（AGP）的测序数据（全霰弹枪测序和16S rRNA）的分析表明，不止一种O. formigenes菌株可能定植于人类肠道，I组菌株比II组（46，51）更普遍。这两项分析还表明，O. formigene的相对丰度变化为3个对数，平均值为2.9×104，强调当使用分子方法（包括PCR）时，粪便中的O. formigene数量有时可能等于或低于检测限。

儿童不会被O. formigenes定植，“直到他们开始在环境中爬行”（52）。对啮齿动物的对照研究也证实了O. formigenes水平传播（53，-55）。Cornelius和Peck在大鼠中进行了一项非常优雅的研究表明，所有后代的定植直到断奶后7天才发生，重要的是，在断奶仔猪从其定植的生母转变为每个携带不同O. formigenes菌株的养母之后，定植来自养母，而不是生母（53).在我们的实验室中，我们还在成年常规小鼠和gnotobiotic小鼠中解决了这个问题。当相同数量的常规O. formigenes菌株OxCC13定植小鼠和非定植小鼠共养时，非定植小鼠被O. formigenes定植，确认水平传播。将单个O. formigenes菌株OxCC13单定植的gnotobiotic小鼠引入到四只非定植，无菌小鼠的笼子中也导致所有无菌小鼠都被O. formigenes定植（55）。

我们关于O. formigenes的知识的主要差距之一是缺乏关于影响O. formigenes定植的因素的信息。对人类（56），小鼠（57）和大鼠（58）的受控饮食研究表明，膳食草酸盐和钙对O. formigenes数量有深远的影响。还有证据表明，大鼠的管腔脂肪含量（59）抑制了O. formigenes减少尿草酸盐排泄的能力;然而，目前尚不清楚这是否是人类的一个促成因素。Jiang及其同事确定了健康人类受试者粪便中的O. formigenes数量，发现粪便细菌数量增加了12倍，因为膳食草酸盐增加了15倍（无花果。9) (56）. 值得注意的是，膳食钙摄入量增加5倍，由于钙对草酸盐的高亲和力，这将限制草酸盐的生物利用度，粪便O. formigenes数量减少约5倍。草酸盐的依赖性以及膳食钙与甲酸O.formigenes数量之间的反比关系可能导致肾结石形成者定植的丧失，因为鼓励这些患者保持足够的钙和低草酸盐摄入量。这种潜在的动态值得进一步调查。

图9

人类受试者粪便中O. formies的量相对于膳食草酸盐（红色三角形）或膳食钙（黑色方块）的变化。不同草酸盐饮食阶段的每日钙摄入量为1，000毫克，不同钙饮食阶段的每日草酸盐摄入量为250毫克。采用实时定量PCR（qPCR）定量产氧疣菌数量，5.5×104CFU/ng DNA用于将qPCR数据转换为每克粪便中产甲烷O.的数量（108）。误差线代表SEM。（经威科集团健康许可改编自参考文献56。

两项针对人类的大型队列研究调查了O. formigenes-宿主的关系。Kelly及其同事对94名O. formigenes定植受试者和146名非定植健康个体的分析没有显示性别，种族，教育，美国居住地区，体重指数，尿路感染史，肾结石家族史和利尿剂使用对O. formigenes定植频率的任何影响（47）。在对AGP数据库中4，900多个样本的多变量分析中，O. formigenes的相对丰度与年龄增加，女性性别，高加索种族，非美国居民，正常BMI，更高的教育程度以及一年内没有抗生素暴露有关（51）。有趣的是，在完成食物频率问卷的197名受试者中，O. formigene相对丰度与膳食草酸盐摄入量没有显着相关性，但与膳食钙摄入量和膳食草酸盐与膳食钙摄入量的摩尔比呈负相关（51）。在这方面，包括印度、中国、韩国和日本在内的一些东方国家的膳食钙摄入量远低于美国。（60）. 鉴于这些研究的不同发现，需要进一步调查文化、人口统计学、基础医疗条件、西药获取和饮食如何影响不同人群的甲氧藻发病率。

口服抗生素的使用和年轻时的抗生素暴露与人类结石形成的风险增加有关（61，-）和63 福尔莫菌定植率降低（定植率降低（47）。O. formigene的人类菌株对常见的抗生素敏感（64）。Sidhu等人认为，囊性纤维化患者中O. formigenes定植的低频率是由于广泛使用抗生素（65）。Sidhu等人还报道了与抗生素治疗的明确关联，并且在草酸钙结石形成者中缺乏O. formigenes定植（66）。Siener等人评估了用抗生素治疗复发性尿路感染（UTI）的女性草酸钙结石形成者中产酸O. formi的定植和尿草酸盐排泄的关系，发现与没有复发性UTI的女性相比，该队列中的尿草酸盐排泄量显着更高（67）。Kharlamb等人在观察接受三联抗生素治疗幽门螺杆菌感染的个体时观察到了相同的关联（68）。抗生素使用后草酸降解细菌（如O. formigenes）的丢失被认为会导致尿草酸盐排泄增加而导致肾结石风险增加（65）。

O. formigenes定植是否受到其他微生物的影响尚不清楚，并且仅在一项使用O. formigenes定植的gnotobiotic小鼠模型的研究中得到解决（55）。这项研究表明，将七种非草酸盐降解细菌（改变的Schaedler菌群）的确定混合物引入用O. formigenes菌株OxCC13单定植的小鼠中对O. formigenes肠道数量或O. formigene降解肠道草酸盐的能力没有影响。 未来对侏儒生物小鼠的研究应解决其他草酸盐降解剂对肠道O. formigenes数量和草酸盐稳态的影响。未来的研究也可能考虑使用肠道恒化器模型（69），因为这些体外方法可以直接评估无宿主环境中微生物群落的动态。事实上，它是一种产甲烷，草酸盐降解富集培养物，在具有绵羊瘤胃内容的化学恒温器中建立，产生第一个厌氧草酸盐降解细菌O. formigenes菌株OxB（10，19，70）。

在我们自己的研究过程中，我们观察到除了定植的持续时间外，还有其他未知因素会影响小鼠的O. formigenes定植。例如，我们之前报道了AGT（lanine-glyoxylate amino t ransferase）敲除小鼠可以用O. formigenes菌株OxWR定植，但在大约2周后开始迅速失去定植，到7周时，所有AGT敲除小鼠都失去了定植（71）。最近，我们还报道了腺瘤（DRA;Slc26a3）敲除小鼠很容易用O. formigenes菌株OxWR定植，但以与AGT敲除模型类似的方式失去定植（72）。有趣的是，DRA/AGT的双重敲除对O. formigene菌株OxWR定植具有抗性（72）。同样值得注意的是，所有C57BL / 6对照队列口服强饲用O. formigene菌株OxWR，OxCC13或HC-1维持定植数月常规食物（54，57）。C57BL / 6对照小鼠的一项研究也表明，产氧O. formigenes菌株OxCC13的定植对短期膳食草酸盐剥夺具有抵抗力（57）。据推测，一些小鼠品系的管腔环境，也许是一些人类，对O. formigenes定植不感兴趣，或者只是暂时接受。检查宿主物种之间肠道草酸盐分泌、肠道化学组成和肠道微生物组的差异，可以进一步揭示影响产甲烷菌定植的因素。

自1980年发现以来，一直在考虑O. formigenes作为草酸钙肾结石病患者治疗的潜力。尿草酸盐排泄增加是此类结石发展的公认危险因素（73）。高膳食草酸盐吸收导致草酸盐输送到肾脏增加，从而增加草酸钙肾结石形成的风险。由于哺乳动物身体天生不具有能够代谢草酸盐的酶，草酸盐降解的肠道微生物群可能会影响尿草酸盐排泄。与少量人类受试者的早期病例对照研究表明，与O. formigenes定植可能预防结石病，因为与非定植个体相比，O. formigenes定植的尿草酸盐排泄测量较低（62，74，75）。然而，草酸盐排泄存在很大差异，并且在尿液收集过程中缺乏对膳食草酸盐和钙的控制。另一项研究显示，与食用标准化饮食的O. formigenes阴性患者相比，O. formigenes定植肾结石患者的24小时尿草酸盐排泄和血浆草酸盐显着降低（76）。还发现定植与结石发作次数呈显著负相关（76）。1995年，Han等人首次显示O. formigenes定植与结石形成之间存在反比关系（77）。Kaufman等人后来在更大的患者队列中表明，O. formigenes定植与复发性肾结石形成的风险降低70%有关（78）。这种反比关系已经在许多随后的研究（62，75，76，79，80）中得到证实。尽管有大量研究表明O. formigenes定植与结石病之间存在反比关系，但在24%的研究中，O. formigenes的定植仅显示较低的55小时尿草酸盐排泄，这表明其他因素可能有所贡献（81）。这些结果可能部分可以通过Jiang及其同事的对照饮食研究来解释，他们显示，与非定植个体相比，自然定植的O. formigenes的健康个体（人类）仅在摄入草酸盐含量中等高和钙含量低（无花果。10) (（第56页）。

图10

（A和B）未定植（黑色方块）和在草酸盐（A）和钙（B）变化的营养控制饮食中用O. formigenes（红色三角形）定植的健康受试者的24小时尿草酸盐排泄。草酸盐饮食的每日钙摄入量为1，000毫克，钙含量不同的饮食的每日草酸盐摄入量为250毫克。在250mg草酸盐/ 400mg钙饮食中，与非定植个体相比，产氧O.formigene定植的个体排泄的尿草酸盐明显少;由 *，P= 0.026 表示。误差线代表SD。（经威科集团健康许可改编自参考文献56。

虽然还有其他肠道微生物可以降解草酸盐（“通才”），包括一些双歧杆菌和乳酸杆菌菌株（82），但小鼠研究表明，在减少尿草酸盐排泄方面，福米生成O. formigenes优于其他微生物。例如，虽然O. formigenes菌株HC-1定植导致常规（C90BL / 57）小鼠尿草酸盐排泄减少6%，71 但动物双歧杆菌定植导致44%减少（定植导致44%减少（83）。同样，在嗜酸乳杆菌和加氏乳杆菌小鼠定植后，在尿草酸盐中观察到减少34%和32%（54）。产甲烷O.菌定植对尿草酸盐排泄的这种优越作用可能是由于诱导肠道草酸盐排泄和高效腔内草酸盐降解的双重作用。

过去十年的先进“组学”研究允许对健康个体和肾结石形成者的肠道微生物组进行更深入的检查（81，84，-91），并证明（i）O. formigenes是导致胃肠道饮食草酸盐降解的多物种细菌网络的中心，以及（ii）来自结石形成者的粪便样本具有显着较低的基因细菌代表 参与草酸盐降解，这可能导致该队列中尿草酸盐增加。在对人类微生物群的多组学数据（来自>3，000名受试者的>1，000个样本）分析中，Nazzal等人（84）表明，在能够草酸盐降解的各种细菌中，O. formigenes在健康成年人中转录主导此功能。此外，他们证明炎症性肠病（IBD）患者的肠道草酸盐水平升高，草酸盐降解基因的转录率低。有趣的是，他们的数据表明，没有O. formigenes定植或低于检测水平的定植是草酸盐降解功能降低的原因。

来自健康非肾结石形成个体的人粪便中福米亚克罗曼的计数表明，福米亚克罗曼菌只占总肠道微生物群的一小部分（56）。许多这样的低丰度细菌被认为通过占据特定的营养生态位在肠道中存活，其中对其食物来源的竞争有限（92）。事实上，体外培养研究（93）和人体研究（56）都表明，O. formigenes比其他肠道细菌更有效地利用草酸盐。Jiang及其同事（56）还表明，在草酸盐摄入量低时，非定植个体微生物组的草酸盐降解能力可以忽略不计，但随着适应摄入更高水平的膳食草酸盐而增加;每日膳食草酸盐摄入量为250mg和750mg的粪便中回收的草酸盐分别为∼80%和∼60%（无花果。11).

图11

在草酸盐含量不同的营养控制饮食中定植的O. formigenes粪便草酸盐（黑条）和非定植的健康受试者（红色条）。每日钙摄入量为1，000毫克。误差线代表SEM。（经威科集团健康许可改编自参考文献56。

许多啮齿动物的报告记录了肠道产氧杆菌在减少尿中草酸盐排泄的有益作用。最初，这被认为是由于O. formigenes降解草酸盐的膳食来源，从而限制了其吸收。然而，后来的研究表明，肠道O. formigenes具有独特的双重作用，通过促进肠草酸盐从体循环中消除与宿主肠上皮相互作用，这与肾脏排泄（显着减少相关58，59，71，72，94）。在大鼠和小鼠中的这些观察结果导致O. formigenes（菌株OXWR和HC-1）可能产生促分泌素，一种本质上可能是蛋白质的物质（95），其介导跨上皮草酸盐转运在定植肠道组织中的改变（58）。此外，即使膳食草酸盐的供应可以忽略不计，这种将产甲烷的必需底物（草酸盐）从血液运输到肠道的机制也可以解释甲虫的存活（57）。

最近的一项体外研究表明，来自O. formigenes菌株OxB培养物的无细胞上清液刺激人肠道Caco-2-BBE细胞中的草酸盐分泌（95）;然而，这些发现没有被另一组复制（14），值得进一步研究。Arvans等人（95）还表明，直肠施用来自O. formigenes菌株OxB培养物的无细胞上清液导致PH1小鼠模型中尿草酸盐排泄减少;然而，仍然需要利用静脉内施用的草酸盐同位素直接测量肠道草酸盐分泌，然后在肠道中测量，以量化该途径的程度。令人感兴趣的是OxThera Pharmaceuticals于2015年提交的一项专利，该专利涵盖了分离和管理源自O. formigenes的促泌剂的发明，这些促泌剂可以增强草酸盐分泌到肠腔中（96）。尽管该专利中描述的工作没有确定任何令人信服的促分泌剂候选药物，但鉴定诱导草酸盐分泌的一个或多个由O. formigene分泌的生物活性因子可能是减轻PH1患者草酸盐负担的有效疗法。

之前，一项研究已经解决了对缺乏甲氧菌的个体进行定植的能力，在该研究中，两名未定植于甲醛奥氏菌的健康成年人在摄入含有∼10的高草酸盐餐后被定植8培养活的O. formigenes菌株HC-1细胞（97），随后保持定植9个月。尽管这项研究让受试者在成功定植O. formigenes之前食用高草酸盐餐，但一项针对小鼠的研究表明，定植可能不需要用补充草酸盐的饮食“启动”（54）。因此，未来的人体研究应该探索口服福米基因O. formigenes后成功定植是否需要富含草酸盐的饮食。其他研究检查了摄入O. formigenes后定植的研究并不成功。由OxThera公司进行的临床试验，其中O. formigenes菌株HC-1以冻干形式在肠溶包衣胶囊内或作为冷冻糊剂提供给PH1患者，导致只有少数患者在治疗后保持定植（98，99）。最近的临床研究也没有显示尿草酸盐排泄与对照（相比显着减少99，100）。这些研究中人类定植频率低的原因目前尚不清楚，但可能包括：（i）与提供的接种物（菌株HC-1）的配方或如何向患者施用接种物有关的问题;（ii）PH1患者对未确定宿主因素定植的抵抗力;或 （iii） 这些患者中未知的肠道微生物组相关因素。然而，应该注意的是，一项涉及非定植健康成人的人体研究（97）表明，在摄入大量产甲烷菌菌株HC-6（18活细胞）口服草酸钠负荷（2毫摩尔/ 70公斤体重）;摄入O.甲虫前尿草酸盐排泄量为3.0±0.6mg/h（n= 4），而摄入甲虫为1.9±0.1mg/h。因此，非定植结石形成者中更具弹性的O. formigenes定植可能是帮助降低草酸钙结石形成者结石风险的有效方法。

一项正在进行的临床试验（NCT03752684;clinicaltrials.gov）在阿拉巴马大学伯明翰分校与健康人类志愿者一起测试未定植的O. formigenes个体是否可以用O. formigenes菌株OxCC13的活培养物定植。还正在评估在O. formigene定植之前和之后固定草酸盐饮食中尿草酸盐排泄的变化。该试验表明，健康个体在摄入单剂量 ∼10 后很容易定植10活培养的O. formigenes细胞，15名参与者中只有一名在摄入O. formigenes后6个月失去定植。

关于O. formigenes如何建立和维持肠道定植，还有很多东西需要了解。解开这些机制对于非定植结石形成的定植可能尤为重要。有必要进一步研究宿主来源草酸盐的定植恢复力和肠道分泌的因素。此外，鉴于O. formigenes临床试验失败，显然需要更全面的检查：（i）作为纯培养物，作为合成草酸盐降解微生物联盟的成员，或作为O. formigenes粪便微生物移植的一部分，以最佳方式输送这种严格的厌氧菌的最佳实践。-定植供体;（ii）肠道中草酸盐降解和非草酸盐降解细菌之间的相互作用;以及（iii）这些细菌如何共同影响尿草酸盐排泄和结石风险。