受保护表面的细菌定植，是否会受运动型和趋化性影响（细菌突变）

文|书生侃侃谈

编辑|书生侃侃谈

引言

在自然界中，细菌定植在各种生物和非生物表面上，形成复杂的细菌生态系统，这些表面上的细菌群体可以形成生物膜，形成一种受保护的状态，本文研究的目的是通过实验观察和分析，探究受保护表面的细菌定植是否会受到运动型和趋化性的影响。

研究表明，在受保护表面上，某些细菌菌株的运动型明显受到限制，其运动速度较慢或几乎无法运动，而其他菌株则在受保护表面上表现出较好的运动能力，这表明受保护表面对细菌的运动能力产生了明显的影响。

设置表面细菌定植

在这项工作中用于测量细菌表面定植的设置，是在透氧载玻片和网格之间浇注厚度为0-27μm的水凝胶层，随后放置在钛流动室中，允许凝胶上方的介质连续交换，鉴于水凝胶层只有几百微米厚，化学物质在凝胶上的扩散发生在几分钟的时间尺度上。

因此允许该层中化学环境的有效交换，水凝胶保护其中的细胞免受流动的影响，因此细胞仅在网格上方的流动中携带，而不是在网格下方，待测试的细菌悬浮在标准的“运动性”缓冲液中，该缓冲液最佳地支持细菌运动性和趋化性，但不支持细菌生长。

为了在细胞悬液中诱导低水平的氧气，在将细胞生长到指数中期后，我们将它们集中在运动缓冲液中以OD600=1，然后将细菌悬浮液在封闭管中平衡，并从管底部吸入流动室，显然，当将这种细菌悬浮液插入毛细管中时，距离液体/空气界面大于~2mm的细胞不会游泳，这表明细胞悬液内的氧气水平非常低。

由于氧气通过透氧表面进入并被流动室中的密集细菌种群消耗，因此在水凝胶层上形成氧气梯度，表面附近的氧气水平升高，随着细菌进入水凝胶层，预计详细的氧气分布将被动态修改，如下图所示。

使用透氧表面对于观察表面定植显然是必不可少的，使用具有透射光或荧光显微镜的倒置显微镜监测凝胶层表面和内部细胞的积累，实验在30°C下进行，这是趋化性行为测定中常用的温度。

作为测试案例，我们首先研究了常用的大肠杆菌实验室菌株MG1655的行为，该菌株包含运动主调节器flhD上游的插入元件IS1，每个实验都从启动细菌悬浮液通过腔室的流动开始，并且随着时间的推移监测表面细胞的积累。

细菌细胞可以在引入流动室后30-40分钟在表面检测到，并随着时间的推移继续积累，在这些实验中，与这项工作中报告的大多数实验一样，流动室的方向是透氧表面朝下，在透氧表面朝上的实验中测量了类似的细菌积累，当水凝胶密度从0.27%增加到0.4%或使用非运动细菌时，细菌细胞无法到达表面。

接下来，我们测试了氧气在观察到的细菌积累中的重要性，我们用不透氧的载玻片代替透氧表面重复实验;在这种情况下，无法检测到细胞的积累，我们构建了一种缺乏初级氧传感器Aer的MG3衍生菌株;这些突变细胞的积累显著减少，AVE3细胞在标准半固体琼脂平板中表现出正常的趋化行为。

表明当天冬氨酸或丝氨酸梯度驱动集落扩增时，AVE3菌株的趋化能力通常与野生型MG1655菌株相似，这些观察表明，氧气确实在地表定植过程中起着关键作用，细菌细胞在表面上的积累对流动室的方向不敏感，被更高的凝胶密度阻挡，需要细菌运动，并且严重依赖于透氧表面和Aer传感器的存在。

在表面定植设置中进行测试时，所有这些菌株都显示出相似的表面定植动力学，但MG1655菌株除外，该菌株表现出不同的行为，MG1655细胞可以更早地在表面检测到，并且积累得更快，达到更高的水平，在这项工作中测试的条件下，表面定植对大多数菌株之间的差异不敏感，除了MG1655菌株具有明显的优势。

分析运动性和趋化性

尽管水凝胶原则上可以被细菌细胞接近，但非运动细菌无法到达表面，因此表明细菌运动对于在这些条件下的表面定植至关重要，为了进一步确定促进表面定植所需的基本细菌特性，我们分析了具有特异性运动性和趋化性缺陷。

使用三种运动但非趋化性菌株测试细菌运动对表面定植的贡献;UU1250和UU2612菌株是RP437菌株的衍生物，缺乏所有已知的化学感觉受体，AVE2菌株是缺乏反应调节因子CheY的MG1655菌株的衍生物，这些运动但非趋化菌株几乎无法到达表面，事实上，它们表现出与非运动菌株相当的行为。

这些非趋化菌株不仅缺乏传感能力，而且还有望表现出平稳的游泳行为，而不是野生型细胞的“奔跑和翻滚”行为，为了测试细菌趋化性在表面定植中的作用，以及它对细菌内在游泳性状的影响，我们使用了获得的另一种菌株，如下所示。

我们将菌株UU1250的细胞接种在软琼脂平板中，并在30°C下在强选择性压力下孵育平板，以获得具有改善通过水凝胶扩散能力的细胞，经过大约48小时的孵育，在此期间细菌几乎没有扩散，观察到明显的长出凸起，我们分离了其中一个突变体，并确认这种新菌株在软琼脂中的传播确实是均匀的。

这种AVE4菌株的细胞在软琼脂中的扩散仅略好于非运动细胞，远低于野生型趋化细胞，测序表明，该菌株在磷酸酶cheZ基因中具有转座子插入，磷酸酶活性的缺乏，加上磷酸化-CheY的相对较长的寿命和CheA或乙酰磷酸盐残留的磷酸化活性，可导致大量磷酸化CheY，从而导致翻滚。

显然，与亲本UU1250菌株的平稳游泳行为相反，AVE4突变细菌表现出奔跑和翻滚的游泳行为，其游泳方向频繁切换，对均匀混合到大部分水凝胶中的细菌群体中游泳细胞的比例的定量表明，能够改变其游泳方向的细菌往往更具运动性，当测试表面定植时，表现出奔跑和翻滚游泳行为的非趋化性AVE4菌株比亲本非趋化性菌株更有效地定植表面。

受影响的细菌

与非趋化衍生品菌株相比，RP437菌株的积累更快、更增强，包括表现出开关运动，MG1655菌株的积累明显比其aer衍生物，缺乏初级氧传感器，但在软琼脂平板中保持正常的趋化能力。

Aer传感器的这种实质性影响进一步表明，空气滑行在观察到的表面积累中起着重要作用，请注意，在没有Aer的情况下，Tsr传感器会导致残留的细菌积聚，用不透氧载玻片代替透氧表面可消除细菌积聚，一方面，表面对氧气的渗透性，另一方面由细菌悬浮液引起的低氧水平，预计将导致凝胶层上的氧气梯度，其方式与参考相似。

显然，当在毛细管中测试细菌悬浮液时，细胞在距离液体/空气界面的距离不超过~2毫米处游泳，这表明那里的氧气水平很低，在透氧表面附近，细菌细胞剧烈游动，表明表面附近的氧气水平明显升高，对凝胶层中氧浓度的预期变化的简单估计表明，这种变化可能大于30%。

鉴于细胞对氧气的半最大响应可低至0.7μM并且细菌典型的“跑步”长度为10μm，可能触发气态反应的氧气梯度可以小于0.07μM/μm，对应于30μm凝胶层上约400μM的氧气差异，这种差异大约是空气/液体界面处氧气浓度的10%。

在这里测试的条件下，空中出租车似乎确实是可行的，显然，其他因素也可能在观察到的表面定植中发挥作用，特别是在涉及细菌生长的实验中，在这种情况下，生长培养基中的营养物质甚至细菌产生的化学物质也可能影响它们的分布，在生长期结束时变得更加明显。

将MG1655菌株与其他趋化菌株揭示了MG1655菌株的独特行为，因为它迅速接近含氧表面并直接在表面积累，而RP437细胞与其他菌株类似，倾向于积聚在水凝胶层的大部分内，MG1655应变的这种趋势也导致其接近表面的能力明显增强。

不同菌株在水凝胶中的不同分布随着时间的推移而持续存在，因此似乎反映了两种菌株的质的不同偏好，而不是动态效应，趋化能力不仅增强了表面定植，而且还提供了一种使细菌在这种环境中的空间组织多样化和控制的手段。

MG1655菌株与本工作中测试的所有其他菌株之间一个很好的运动相关差异是FLHDC操纵子上游IS1插入元件的独特存在，该元件编码运动主调节器，先前表明，该位置的各种插入可导致不同的趋化行为，AVE1菌株的行为仍然与其亲本RP1菌株的行为基本相似，该菌株携带IS5插入元件而不是其原始IS437元件上游flhD基因。

flhDC调节区域不会导致MG1655菌株的独特行为，另一个候选者是Aer传感器，它在这项工作中测试的条件下，该传感器在RP437细胞中的表达升高仍然不能促进类似于MG1655菌株的行为，为了确定这项工作中使用的特定菌株的不同行为的其他候选者，我们对RP437菌株相对于MG1655菌株的突变进行了全基因组搜索。

作为候选者，该搜索鉴定了crp基因和rpoS基因，与MG437菌株相比，RP3110和W1655菌株中两者都发生了突变，这两种基因确实可以影响细菌运动，由于该分析不包括基因组插入，因此其他候选者也是可能的，并且MG1655菌株独特行为的机理解释有待进一步研究。