文|丙灿说
编辑|丙灿说
引言细菌和真菌是自然界中最为广泛存在的微生物群体之一，它们在生态系统中扮演着重要的角色，本文研究的目的是探究细菌和真菌在不同环境条件下的突变适应性，以及这些适应性变化对它们之间相互作用的影响。
研究表明，在不同的环境条件下，细菌和真菌表现出了不同的突变适应性，一些突变株表现出了对特定环境的适应性增强，如在高温环境下细菌产生了耐热突变株，而真菌产生了耐寒突变株。
我们选择了一组奶酪皮微生物组中常见的8种真菌，它们都属于子囊菌门，这些真菌包括两种酵母，分别是念珠菌属str.135E和Debaryomycessp.str.135B，以及六种丝状真菌，包括青霉菌属#12、青霉菌属SAM3、青霉菌属RS17、镰刀菌属554A、Scopulariopsissp.str.JB370和Scopulariopsissp.str.165-5。
在细菌方面，我们选择了两种Gammaproteobacteria，分别是嗜冷假单胞菌STB418和大肠杆菌K12BW25113，变形杆菌是奶酪皮群落的常见居民，并且已被证明在实验群落条件下对真菌的存在有反应，嗜干假单胞菌ST.JB418最初是从奶酪皮中分离出来的，大肠杆菌K12被选为细菌伙伴，以便利用其可用的遗传资源。
为了评估每个基因在实验条件下的重要性，我们使用了条形码转座子插入突变体的汇集库，RB-TnSeq18，这种方法能为每个基因生成一个适应度值，反映了该基因在实验条件下的生存重要性，负适应度值表示破坏该基因导致相对于野生型菌株的生长减少，正值表示生长增强，而从0开始的值则表示基因破坏的影响更强。
我们进一步通过将嗜冷假单胞菌16或大肠杆菌18的RB-TnSeq突变文库与奶酪凝乳琼脂平板上的八种真菌之一混合，来鉴定在真菌伴侣存在下与单独生长相比具有显着不同适应值的细菌突变体，我们选择了7天的时间点，因为在这个时间点能捕获到与真菌产生的特定代谢物相关的相互作用，如孢子形成等。
这些适应度值之间的差异在后文中被称为“交互适应度”，在某些情况下，真菌的存在增强了细菌突变体的适应性，而在其他情况下，细菌突变体的适应性降低。
我们总共发现了731个大肠杆菌基因和1606个嗜冷假单胞菌基因，它们的破坏导致在至少一个真菌伴侣存在的情况下，细菌的健康状况发生变化，这表明在每个真菌条件下，平均有216±50个大肠杆菌基因和576±122个嗜冷假单胞菌基因具有相互作用适应性。
大肠杆菌的相互作用适应度值范围为-5.66至5.71，而嗜冷假单胞菌的范围为-6.18至5.74，凸显了真菌对细菌的巨大积极和消极影响。
为了评估适应性效应的保守性，我们确定了大肠杆菌和嗜冷假单胞菌之间的同源基因，在同一组真菌条件下，具有大肠杆菌和嗜冷假单胞菌相互作用适应性的88个基因集富含氨基酸生物合成中的基因，包括异亮氨酸/缬氨酸生物合成相关基因。
这些基因与两种细菌都具有负相互作用适应性，这表明真菌可能正在竞争奶酪中可用的氨基酸，我们之前已经观察到这些基因对奶酪上的大肠杆菌生长非常重要，这表明在这种培养基中可能存在氨基酸的限制。
为了评估真菌对细菌影响的特异性，我们对整组真菌相互作用条件进行了评估，大约21%的大肠杆菌相互作用相关基因和32%的嗜冷假单胞菌相互作用基因在八种真菌相互作用条件中的至少四种中是共同的，除了保守效应外，我们还观察到了大量的真菌物种特异性效应。
对于大肠杆菌而言，45%的相互作用适应度基因是特定于单个真菌条件的，而对于嗜冷假单胞菌，这个比例为37%，特别地，对于大肠杆菌和嗜冷假单胞菌而言，青霉菌属#12和青霉菌属SAM3的生长条件导致大量具有显着相互作用适应性的相同基因，在主成分分析中，这些真菌物种也远离其他真菌。
为了确定细菌-真菌相互作用的潜在机制，我们使用了多种方法的组合：直系同源基因分类簇、功能富集分析以及跨真菌物种的影响保护分析，青霉菌属#12和青霉菌属SAM3对细菌突变体适应性的影响一致。
这表现在它们拥有大量相似的网络连接，受这些真菌影响的基因集表明，这两种真菌物种可能通过产生抗生素分子来引起细菌的包膜应激，因为它们包括药物外排泵、包膜应激反应系统、青霉素结合蛋白和脂多糖/肽聚糖生物合成基因，在存在这两种真菌的情况下，多药外排泵MdtK的破坏导致适应性降低。
我们进行了细菌细胞学分析27，这是一种基于显微镜的方法，用于预测抗生素的作用机制，我们分析了单独生长的WT或ΔmdtK大肠杆菌以及与青霉菌属#12或青霉菌属SAM3混合生长的情况，显微镜观察显示，与单独生长相比，在与青霉菌一起生长时，WT和ΔmdtK大肠杆菌的细胞形态发生了明显变化。
与单独生长相比，当与这些真菌一起培养时，大肠杆菌细胞变得更加圆形，这与细胞壁完整性的降低一致，而ΔmdtK细胞则受到更强烈的影响，并表现出球状体，这表明细胞结构完整性完全丧失，对已知抗生素化合物的对照实验表明，这种效果类似于靶向细胞壁生物合成的抗生素，如美西林和阿莫西林。
先前的研究表明，在其他子囊菌真菌中，真菌特化代谢物的产生受到全球监管基因LaeA的控制，为了测试该基因对潜在抗生素活性的贡献，我们在青霉菌属#12中生成了一个ΔlaeA突变体，当WT大肠杆菌细胞与青霉菌#12ΔlaeA一起生长时，细菌细胞的形态明显不那么圆润。
这表明全球调节因子LaeA的丧失可能会降低真菌抗生素的产生，这两种真菌菌株都不是青霉素的已知生产者，对青霉菌属#12基因组草案的分析也未能检测到青霉素生物合成基因簇，这两种真菌都引起了一致的形态学和遗传效应，表明细胞包膜应激可能与β-内酰胺类抗生素的作用机制相似。
嗜冷假单胞菌RB-TnSeq数据显示，与生物素生物合成相关的基因的破坏导致与大多数真菌的负相互作用适应度，这些基因集代表了合成生物素所需的所有基因，生物素存在于我们的奶酪凝乳琼脂培养基中，浓度为73nmol/mg，是参与氨基酸代谢和脂质合成等关键细胞功能的酶的必需辅助因子。
在大肠杆菌中，生物素生物合成基因单独具有中性适应性，在我们的RB-TnSeq实验中没有显示出相互作用适应性，单独生长或在青霉菌属#12存在下生长的大肠杆菌的RNA-Seq表明，在青霉菌属#12存在下，bioA、bioB、bioC、bioD和bioF基因都显着上调，平均倍数变化为4.4。
由于奶酪是一个铁限制的环境，微生物物种需要铁螯合剂来进行生长，我们的RB-TnSeq适应性数据显示，大肠杆菌突变体在其铁载体肠杆菌素运输方面存在缺陷，在单独条件下生长不良，任何真菌伴侣的存在显著改善了编码肠杆菌素转运功能的fep操纵子中突变体的生长，这一发现得到了通过分离肠杆菌素摄取突变体进一步验证。
在嗜冷假单胞菌JB418中，虽然以前没有表征铁载体的产生和摄取，但三个假定的铁相关基因显示与大肠杆菌fep基因相似的效果，即在单独条件下存在适应性缺陷，但与任何真菌存在下具有正向相互作用：Ga0212129_113525，Ga0212129_115698和Ga0212129_114260。
这些基因分别被注释为铁复合物外膜受体蛋白、推定的铁依赖性过氧化物酶和未表征的铁调节膜蛋白，在Ga0212129_114260基因的上游，我们发现肠杆菌素铁受体和肠杆菌素铁受体所需的PfeR-PfeS双组分调节系统，虽然用肽和吡咯是两种众所周知的铁载体，抗SMASH不能预测嗜冷假单胞菌中的这些铁载体。
接下来，研究人员研究了真菌物种的存在是否改变了铁载体摄取缺陷菌株的生长，对于ΔfepA和ΔfepC这两种铁载体摄取缺陷的大肠杆菌突变体，它们在最接近丝状真菌的地方恢复了生长，但在酵母附近则没有恢复。
对于丝状真菌，这种效应取决于fhuA或fhuE，大肠杆菌很可能利用由丝状真菌产生的真菌异羟肟酸铁载体，并通过Fhu系统吸收其中的铁，独立于肠杆菌素摄取系统。
由于铁的限制是许多环境中的共同挑战，研究人员进一步研究了来自其他生态系统的真菌物种是否也能产生邻近的细菌物种可以访问的铁载体，他们对烟曲霉和厚皮马拉色菌进行了类似的测定。
结果显示，烟曲霉产生的铁载体能够通过FhuA被大肠杆菌利用，类似的效果也观察到使用厚皮分枝杆菌，表明细菌能够利用Fhu系统，对厚皮马拉色菌基因组的分析还揭示了含有铁铬肽合成酶的NRPS生物合成基因簇，这进一步证明了这种真菌可以产生可供细菌利用的铁载体。
研究结果表明，突变适应性可能影响细菌和真菌之间的相互作用，一些突变株表现出了与野生型株不同的共生和竞争策略，在共生关系中，突变株可能表现出更高的亲和力和共生效率，而在竞争关系中，突变株可能表现出更强的竞争能力，这些适应性变化可能导致细菌和真菌之间的相互作用模式发生变化，从而影响生态系统中微生物的物种组成和生物多样性。
参考文献：肖伦格·兰峰，《真菌微生物组的新兴世界》
富内德·比内，《表征细菌和真菌可以提高对拟南芥根微生物组的理解》
努布雷姆·达克奥克，《用于基于测序的真菌多样性研究的不同扩增子靶标》
