文丨粉墨叔叔
编辑丨粉墨叔叔
前言祖细胞协调分化为专门的细胞类型，并将它们的空间组织组织成不同的结构域，这是胚胎发生的核心。鉴定了多种转录因子，其表达模式主要与细胞类型规格或空间位置相关，表明存在两种平行但高度相互关联的调控系统。
胚胎肢体在其空间组织中心之一的扰动下经历了复杂的多尺度*，包括特定细胞群的丧失，预先存在的细胞状态分子身份的改变以及其相对空间分布的变化。多维单细胞、空间分辨的分子图谱如何允许空间身份和细胞命运的反卷积，并揭示在基因改变时调节器官发生及其*的相互关联的遗传网络。
使用MetaCell来鉴定转录均质的细胞群，并重建发育中的肢芽的转录流形。鉴定了109个metacells。作为批次或阶段特异性偏差的对照，我们分析了每个胚胎对不同代谢细胞的贡献。绝大多数metacell由来自所有四个胚胎的细胞组成，这表明在整个分析期间中存在相应的细胞状态。
metacells5、17至19、21和27显示出胚胎#2的偏倚贡献，但胚胎#5没有，这种偏差可以通过样本#2中内侧和远端细胞状态的特定采样或批量效应来解释。metacell27的转录组与metacell26的转录组非常相似。这表明元细胞26和27代表相同的细胞状态，直至批量效应。
使用已知的细胞类型特异性标记将每个metacell分配给肢芽中存在的不同细胞群。间充质细胞状态构成了数据的大部分，并形成了相关细胞状态的连续统一体。
代表成软骨细胞谱系的多个meta细胞，包括Sox9凝聚软骨激素， Col2a1 早期软骨细胞，以及一些阿坎 软骨细胞。每个分化阶段遍布间充质投影。分化为肌腱细胞和韧带成纤维细胞的致密规则结缔组织祖细胞显示Col3a1表达，而分化的更分化的肌腱祖细胞表达Scx。
在分化程度最高的软骨细胞中也检测到Col3a1转录本。其余未承诺的间充质细胞不表达任何典型的成软骨或结缔组织标志物。这种未分化的间充质表现出多种细胞状态，可根据Lhx2和Hand2表达分为两大类。
在这种分辨率水平下，我们没有捕获间充质中沿背腹轴的任何转录差异，尽管我们的聚类允许将AER与背侧和腹侧外胚层分离，但无法将表达Wnt7a的背侧外胚层与表达En1的腹侧外胚层分开。
光学配准的灵活性允许使用与感兴趣结构的空间组织紧密拟合的图案，并通过不同的用户定义的光转换模式捕获其多维组织。对于肢体应用光转换模式来记录沿肢芽的PD和AP轴的细胞位置，相对于到AER的距离。
除内皮和外胚层转运细胞外，超细胞的颜色组成比偶然预期的更均匀，表明元细胞位于精确的空间位置。这一事实支持元细胞代表不同的生物状态，而不是聚类伪像。它直接表明细胞位置是间充质细胞身份的重要组成部分，这反映在位置特异性转录程序的表达上。
尽管单个细胞提供的信息仅限于坐标系的一个轴，但超细胞包含来自所有三个光转换轴的细胞。每个元单元都可以定位到更复杂的14仓空间网格中，通过计算空间概率分布，最大限度地提高观察元细胞颜色组成的可能性。单个元细胞的概率分布通过细胞类型注释进行聚合，从而产生细胞类型空间分布。
这种空间分辨图谱表明，转录相关的meta细胞可以具有显着不同的空间分布，并允许以更高的精度和分辨率探索基因表达。对于每个表达的基因，通过计算在每个空间箱中发现该基因的随机UMI在空间上的概率分布来得出虚拟原位杂交模式。vISH结果与实际的原位杂交实验非常接近。
vISH进一步能够以新的深度和精度可视化跨细胞类型的基因和途径，可以很容易地比较两个或多个基因的表达，但也可以按细胞类型分解基因表达模式。过程特异性基因表达谱也可以组合在一起，以检查整合途径或生物过程的空间分布，例如细胞增殖或信号通路响应细胞。
使用vISH来映射ZPA，ZPA沿AP轴组织肢体模式。其定义基因Shh在四个metacellsShh中强烈表达，这些细胞共同映射到肢体后缘的ZPA。Metacell23和24位于内侧，而metacell26和27位于更远端，这表明它们可能代表以前未知的ZPA亚域。
元细胞26和27可能代表相同的一般状态，并且差异是批次效应或阶段差异的后果的可能性。Tbx2表达水平构成了远端超细胞26和27之间的主要差异，这与Tbx2表达结构域在整个手板形成过程中的远端延伸以及分配给元细胞27的细胞的可能早期发育阶段一致。
几个TF在metacell23和24以及26和27之间显示出差异表达，包括Hand2，Hox和EtsTFs，它们已被证明可以调节Shh表达。这些TFs的保守结合基序存在于极化活性调节序列，Shh肢体增强子的区域内。
ZPA的近端和远端部分之间存在不同的转录机制，这增加了Shh可能在ZPA的不同部分使用不同调节模式的可能性。在近端其活性可能主要由Tbx23和Hand2驱动，其表达在近端较高。而在远端，其他因素可能发挥相对增加的作用。为了支持TF的ZRS相关补体的多样性，ZRS中的突变已被证明沿PD轴不同程度地影响其活性。
应该强调的是，这里提出的通过其ZRS增强剂对Shh进行调节的这些不同制度并不一定意味着将ZPA划分为不同的领域。这些制度可能在ZPA内共存，它们对Shh表达的相对贡献沿PD轴和可能的AP轴变化。ZPA中迄今为止隐藏的调节制度的多样性可能有助于ZRS或ZRS相关TF中的遗传变异引起的肢体形态的多样性，因为它们可能调节ZPA的形状和信号强度。
为了去卷积间充质中运作的空间和细胞类型特异性调控逻辑，将基因分类为主要携带“空间”或“细胞类型”相关信息。编码空间信息的基因在细胞状态中具有相似的表达空间分布，而以严格的细胞类型特异性方式调节的基因在metacell位置的可预测性较差。
使用线性回归从所有基因的每个元细胞的空间概率分布中预测基因表达，并使用F检验计算总体意义。在Bonferroni校正多次测试后，保留了4713个基因的模型。这些基因包括肢体信号通路的主要组成部分。
比较了使用所有高度可变基因或仅使用非“空间调节”HVG计算的meta细胞之间的两个成对相关矩阵。两组远端meta细胞之间的相关性在没有空间HVG的情况下降低，而其中一组与近端软骨造化meta细胞之间的相关性增加。逐个细胞基因表达基质的非负基质分解揭示了可以解释这些变化的基因模块。
NMF模块4对具有强空间调控的已知模式基因表现出高权重，而模块9对软骨生成基因表现出高权重，总体空间调节较低。排除空间调控基因以计算相关性降低了模块4的影响，因此降低了仅位于相似位置的细胞之间的相似性。
随着肢体沿PD轴发育，软骨生成开始，处于不同分化阶段的软骨激素位于不同的空间调控转录组亚空间中，这在很大程度上反映在单细胞聚类中，并可能掩盖位于不同位置的细胞之间的谱系关系。
为了比较不同PD区室中的软骨细胞分化轨迹，逐步构建了软骨生成的单细胞图，使用为来自连续空间位置的细胞组定义的子空间，调整了用于跨时间序列重建细胞轨迹的方法。
在这些基因中，Sox9是软骨形成的关键调节因子。它显示了肢体发育过程中的动态和复杂的调节，涉及超过2Mb的大型调节环境，包括数十种潜在的肢体增强剂。为了评估这种景观是否沿肢体PD轴被相同激活，利用已发表的野生型E11.5肢芽单细胞测定进行转座酶可访问染色质测序数据来鉴定染色质可访问的元件。
使用修拉将沿PD轴的位置和Sox9表达水平从我们的TATTOO-seq数据集转移到scATAC-seq数据，并根据位置和Sox9表达生成伪批量ATAC配置文件。尽管每个类别中的细胞数量有限，但我们能够在Sox0调节域或拓扑关联结构域中检测到七个沿PD轴差异表示的ATAC峰，其中五个对应于先前描述的Sox9增强子。
siTATTOO-seq构成了一种简单，强大和灵活的方法来整合空间位置和单细胞转录组。这里提供的数据和分析说明了TATTOO-seq如何帮助在对胚胎图案所涉及的动态过程进行综合和高分辨率描述方面取得进展。
正交分析，如NMF、主题建模和TATTOO-seq数据上的图流形组装，揭示了模式化和分化特异性基因模块对细胞状态的各自贡献，鉴定介导空间身份的特定TF，并构成解开空间和细胞类型特异性基因调控程序的第一步。
位置信息实质上调节肢体软骨细胞的转录组及其核心分化程序，并表明该核心分化程序通过不同的，特定于上下文的模式在不同的位置上运作，这些模式将位置特异性TF与位置特异性顺式调节元件相关联。
这些差异激活的增强子可以作为共同分化途径的特异性位置整合剂，并且可能是形态学区域化自然和病理变异的主要靶标。
TATTOO-seq进一步提供了对发育缺陷的新的综合和多层次描述，如Fgf8突变肢芽中揭示的复杂细胞，分子和空间变化所示。这种全面的、空间分辨的分子数据可以提供更细粒度的“突变表型”表示，并揭示遗传或环境扰动如何通过发育基因调控网络传播并重新连接它们。
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