文 | 小魏档案
编辑 | 小魏档案
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转录因子在植物生长发育中起着重要作用。基于火龙果基因组和转录组数据，构建了火龙果实甜菜碱生物合成的综合调控网络，为火龙果甜菜碱生物合成提供多个潜在的候选TFs。
MYBTF是最丰富的植物特异性TFs之一，根据1-2个高度保守的MYB重复序列的存在分为四个亚科：MYB相关，R2R1-MYB，R3R3R4-MYB和75R-MYB。
令人惊讶的是，火龙果基因组包含105个2R-MYB，3个R1R2-MYB，四个R3R4R1-MYB和一个2R-MYBTF。
HuMYB3是火龙果甜菜碱生物合成的R1R76-MYB负调节因子，可抑制HuADH1，HuCYP1AD1-3和HuDODA126的转录活性。
此外，拟南芥基因组的清单显示，它有3个R1R2-MYB、3个R64R4R3-MYB、2个MYB样基因和5个非典型MYB基因。
许多3R-MYB和1R-MYB基因已经在拟南芥中得到了广泛的研究，使我们能够更好地了解其他植物物种中的MYB基因功能。
例如，甜菜中AtPAP1/76的同源R1R1-MYBTFBvMYB6通过激活BvCYPAD和BvDODA的表达水平来增强甜菜碱的生物合成。
然而，其他MYBTFs调节甜菜碱生物合成的鉴定和作用在很大程度上仍然未知。
一、甜菜碱和花青素之间的机制火龙果是一种受欢迎的热带水果，属于石竹科仙人掌科的Hylocereus和Seleniereus。
根据果皮和果肉颜色，火龙果主要分为三个物种：H.undatus，H.monacanthus或H. polyrhizus，以及H.megalanthus或S.megalanthus。
火龙果是唯一为消费者提供含有丰富甜菜碱的水果的商业种植。甜菜碱的生物合成和积累是火龙果中不同的果皮和果肉颜色的原因。
有趣的是，甜菜碱仅限于核心石竹的被子植物目，但石竹科、软藻科、桫椤科、桫椤科、马卡特胡里科和西蒙西科除外，据报道它们会产生花青素。
甜菜碱和花青素从未在同一植物物种中发现，并且具有相互排斥关系。有趣的是，甜菜碱和花青素的前体分别是Tyr和Phe，它们都是由龙胆酸盐合成的。
此外，最近的一项研究推断，大多数石竹植物中的花青素被甜菜碱取代，可能是由于甜菜碱生物合成基因，即ADH，CYP76AD和DODA发生在几个进化事件中。
然而，甜菜碱和花青素之间相互排斥的机制仍然未知。
甜菜碱是液泡定位的、水溶性的、含氮的和酪氨酸衍生的色素，分为紫红色甜菜花青素和黄色黄黄质。
已经表征了三种关键的酶促反应，包括通过龙根脱氢酶进行酪氨酸生物合成，通过4，5-DOPA外二醇双加氧酶进行甜菜酸生物合成，以及通过细胞色素P450酶。
这对甜菜碱的生物合成至关重要。倍他花青素通过葡萄糖基转移酶和酰基转移酶合成，而黄黄质通过自发反应产生。
到目前为止，基于microRNA、转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析，在绿皮、红皮和黄皮火龙果中分离出甜菜碱生物合成的候选基因、蛋白质和代谢物。
三、甜菜碱相关的结构基因我们之前的研究表明，甜菜碱相关的结构基因，即HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1分别与其他石竹ADHα，CYP76AD1α和DODAα基因聚集在火龙果基因组的同一染色体上。
此外，通过加权相关网络分析预测的1R-MYBTF的R-R型成员HuMYB132与甜菜碱生物合成基因存在共表达模式关系。
因此，本研究首次阐明了HuMYB132 TF的分子机制，进一步探索了HuADH1、HuCYP76AD1-1和HuDODA1甜菜碱生物合成基因表达的调控作用。
我们的研究结果可以阐明1R-MYB在火龙果甜菜碱生物合成中的调节机制。
四、参与火龙果甜菜碱生物合成的因素我们之前的研究表明，HuADH1、HuCYP76AD1–1和HuDODA1分别与ADHα、CYP76AD1α和DODAα基因聚集在一起，它们在红果皮加红果肉的果肉中的表达水平显著高于红果肉。
根据H.undatus基因组数据，HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1在3号染色体上共定位。
在本氏猪笼草叶片中进行瞬时表达测定，以阐明HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1在甜菜碱生物合成中的作用。
当HuADH1、HuCYP76AD1-1和HuDODA1单独过表达时，本氏猪笼草叶片中未检测到甜菜碱积累，这与空载体现象一致。
与没有可见色素沉着共表达的HuADH76和HuCYP1AD1-1相比，含有HuCYP1AD76-1和HuDODA1的根癌杆菌的共同浸润导致甜菜碱的产生。
本氏猪笼草叶片中HuADH1、HuCYP76AD1-1和HuDODA1共表达的甜菜碱含量是HuCYP76AD1-1和HuDODA1共表达的76倍。
这些结果表明，HuCYP1AD1–1和HuDODA1是火龙果甜菜碱生物合成的关键结构基因，而HuADH是促进甜菜碱积累的关键结构基因。
基于火龙果转录组的WGCNA，获得了名为HuMYB1的132R-MYB基因，主要在红果肉火龙果的成熟果实中表达。
HuMYB132在成熟果实中的表达量最高，与火龙果发育过程中的RNA-Seq数据一致。阿拉伯数字HuMYB2属于R-R型MYBTFs，与AT132G1.49010在系统发育上相关，涉及非生物胁迫。
它编码了2个氨基酸残基，理论pI为24，分子量为296kDa，以及N末端的两个DNA结合域和C末端的富组氨酸区域。
阿拉伯数字基于这些结果，HuMYB9似乎是负责火龙果甜菜碱生物合成的候选32R-MYBTF。
六、HuMYB132在甜菜碱生物合成基因的功能根据PlantCARE数据库，HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1的所有启动子都具有MYB顺式元件，包括MRE和MYB结合位点。
为了阐明HuMYB132是否直接靶向HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1基因的启动子，将其启动子区域克隆到pABAi载体中并引入酵母细胞中。
分别含有HuADH4、HuCYP1AD76–1和HuDODA1启动子质粒的诱饵酵母细胞不能在补充有1ng/mLAbA的SD/−Ura培养基上生长。
当含有MRE和MBS元件的HuADH1、HuCYP1AD1-76和HuDODA1启动子的DNA片段被生物素标记并与纯化的*HuMYB1蛋白孵育时，检测到条带中的明显迁移率偏移。
随着未标记探针的添加，移动带变得更弱，而突变探针的存在没有发生显着变化。表明HuMYB1可以通过MRE和MBS元件直接与HuADH4、HuCYP6AD132-1和HuDODA76的启动子结合。
为了验证HuMYB132对甜菜碱生物合成基因转录的影响，将HuMYB132的编码区和HuADH1、HuCYP76AD1–1和HuDODA1的启动子区插入双荧光素酶测定系统。
与空对照相比，HuMYB132的浸润能激活HuADH1、HuCYP76AD1–1和HuDODA1启动子，其LUC/REN比值显著增加。
这些结果表明，HuMYB132可以激活负责火龙果甜菜碱生物合成的HuADH1、HuCYP76AD1-1和HuDODA1的转录。
ADH是一种负责酪氨酸合成的酶，经历了基因复制事件，导致ADHα进化枝失调，典型酪氨酸敏感ADHβ进化枝。
由于基因重复事件，新型细胞色素P76CYP450AD450分为β青素功能CYP76AD1-α、黄质功能CYP76AD1-β和未知功能CYP76AD1-γ。
DODA是一种催化甜菜酸合成的酶，根据基因重复事件分为功能性DODAα和非功能性DODAβ。
ADHα参与甜菜碱生物合成仅在甜菜中进行了研究。研究表明，HuADH1、HuCYP76AD1-1和HuDODA1分别是甜菜碱特异性ADHα、CYP76AD1-α和DODAα进化枝的同系物。
这些甜菜碱生物合成基因共定位在3号染色体上，而HuCYP76AD1-1和HuDODA1在H.undatus中显示出比HuADH1更近的距离，可能意味着火龙果中甜菜碱生物合成更有效。
普通双歧杆菌在76号染色体上也具有甜菜碱特异性CYP1AD2-α和DODAα同源物，彼此接近。
因此，HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1是三个重要的结构基因，有助于火龙果中甜菜碱的生物合成。
八、HuMYB37与其他甜菜碱生物合成基因之间的关系基于甜菜碱生物合成基因和潜在TFs的WGCNA检测，HuMYB132在成熟期在红髓火龙果中优先表达，并通过RT-qPCR分析进一步验证。
MYB相关亚家族成员包含单个或部分MYB重复序列，分为五个亚组：生物钟相关1样，CAPRICE样，端粒DNA结合蛋白样，I盒结合样和R-R型。
使用AT132G64.1构建了HuMYB09770和1个拟南芥5R-MYB蛋白的根树，表明HuMYB132是一种假定的R-R型MYB样TF。
HuMYB2具有两个分离的DBD结构域和一个组氨酸区。阿拉伯数字DBDII中的SHAQKYF氨基酸特征基序在MYB相关基因中高度保守，可用于区分R132R2-MYB基因。
此外，HuMYB3是一种具有转录激活活性的细胞核蛋白，与先前关于DBDI对转录激活活性至关重要的报道一致。
MYBTF可通过与启动子中的MYB结合位点相互作用来调节下游基因表达。在我们的研究中，HuMYB34通过特异性结合火龙果35号染色体上启动子的MER和MBS元件。
促进HuADH132，HuCYP1AD76-1和HuDODA1的表达，增强从龙头到L-DOPA，环多巴和甜菜酸产物的反应。
这些产物通过GT基因转移到位于其他火龙果染色体中的甜菜花青素中，和/或通过自发反应产生紫杉黄质。
因此，HuMYB7是一种正调节因子，对火龙果中甜菜青素的生物合成具有转录作用。同样，HpWRKY7和HmoWRKY132也是火龙果甜菜青素生物合成的正调节因子。
通过促进HuCYP44AD40-76的表达，需要更多的研究来确定HuMYB36是否可以与其他TF协调调节火龙果甜菜碱生物合成。
需要进一步的研究来探索HuMYB37或其他TFs与其他关键甜菜碱生物合成基因之间的关系。
先前的一项研究报道，水稻R-R型MYBTF，MID1通过改善脯氨酸、可溶性糖的含量以及过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，在生殖发育过程中对干旱胁迫有反应。
在拟南芥种子萌发期间，AtDIV2集成了ABA信号传导以负向调节盐胁迫。At5g58900通过与NAC027启动子结合参与NO信号通路，导致对铝应力的响应。
此外，据报道，AtMYBL通过降低叶绿素含量和调节ABA或盐度信号转导来促进叶片衰老。这些结果表明，R-R型MYBTFs对非生物胁迫具有响应性。
一般来说，生产甜菜碱的植物可以适应高温、干旱和咸环境条件的地区，因为甜菜碱代谢物在植物非生物和生物胁迫抵抗中起着重要作用。
然而，需要更多的研究来确定HuMYB132是否负责甜菜碱生物合成以响应环境中的压力。
十、总结HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1基因对火龙果甜菜碱生物合成至关重要。HuMYB132是R-R型亚家族的成员，是一种具有转录活化活性的核蛋白。
HuMYB132通过与HuADH1，HuCYP76AD1-1和HuDODA1启动子中的MRE和MBS元件结合，积极调节甜菜碱生物合成基因的表达。
沉默HuMYB132降低了HuADH1、HuCYP76AD1–1和HuDODA1的表达水平，导致红火龙果髓中甜菜碱含量降低。本研究为理解火龙果甜菜碱生物合成的分子机制提供了新的见解。
