育肥猪传染性胸膜肺炎的诊断及分离菌毒力基因检测（养猪场MIX）

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌感染引起的一种高度接触性、致死性呼吸系统疾病，以急性纤维素性胸膜肺炎、出血坏死性肺炎或慢性局灶性坏死性肺炎为特征。研究发现，胸膜肺炎放线杆菌有4种外毒素，即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ，是胸膜肺炎放线杆菌的主要毒力因子。

2016年5月份，湖南省浏阳市某规模猪场 50～80 kg 育肥猪群中有3头猪在未发现任何征兆的情况下突然死亡，死后主要表现为鼻孔喷出带血色的泡沫，解剖主要见肺脏间质增宽、水肿，表面布满凝血块，气管内充满伴有血液的泡沫。笔者从发病猪场采集病死猪肺脏样本，进行了细菌分离以及分离菌的染色镜检、生化特性分析、16S RNA PCR测序分析、传染性胸膜肺炎放线杆菌毒力基因测序分析。结果表明，分离菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，且从分离菌中检测到了ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅣ毒力基因，但没有检测到ApxⅢ毒力基因，现报道如下。

1　材料

◆1.1　病料样本

发生急性死亡、鼻孔流出带血泡沫的育肥猪肺脏样本，采自湖南省刘阳市某规模化猪场。

◆1.2　主要试剂

巧克力培养基，上海科马嘉生物技术有限公司产品；革兰氏染色试剂，北京索莱宝科技有限公司产品；Premix Taq 酶，TaKaRa 公司产品；DL-2 000 Marker，康为世纪生物有限公司产品；细菌生化鉴定管，招远拓普生物工程有限公司产品。

◆1.3　引物

16S RNA PCR引物、扩增ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ毒力基因引物，由长沙擎科生物技术有限公司合成。

2　方法

◆2.1　细菌分离培养

无菌条件下取病变肺脏组织，在含有β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的巧克力平板上画线接种，37 ℃培养 24 h。

◆2.2　染色镜检

取培养24 h后的疑似菌落涂片，进行革兰氏染色，于显微镜下观察细菌形态。

◆2.3　生化鉴定

取培养24 h后的疑似菌落接种于含1‰NAD的各种细菌生化鉴定管中，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，观察细菌的生化反应。

◆2.4　16S RNA的PCR检测

反应体系（总体积为15 μL）：Mix 7.5 μL，纯水6.5 μL，上、下游引物各0.5 μL。挑取菌落放入配好的PCR体系中，用移液枪吹打均匀，作为 DNA模板。

反应程序：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸 7 min，15 ℃保存。

◆2.5　毒素PCR鉴定

体系（总体积为15 μL）：Mix 7.5 μL，纯水6.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，挑取菌落放入配好的 PCR 体系中，用移液枪吹打均匀，作为 DNA 模板。

反应程序：94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性30 s，ApxⅠ65 ℃退火 30 s，ApxⅡ63 ℃退火30 s，ApxⅢ、ApxⅣ61 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30 个循环；72 ℃延伸 7 min，15 ℃保存。

3　结果

◆3.1　分离培养结果

分离菌株在 37 ℃ 恒温箱中培养 24 h 后，在含NAD 的巧克力平板上长成直径为1～3 mm、圆形、隆起、表面光滑、边缘整齐的灰白半透明菌落。

◆3.2　染色镜检结果

分离菌株在 37 ℃恒温箱中培养 24 h 后，涂片，革兰氏染色镜检，结果分离菌为革兰氏阴性小球杆菌，散在杆状或短链状，少量呈长丝状。

◆3.3　生化试验结果

取分离菌的纯培养物接种于生化管中，37 ℃ 培养 24 h，结果显示分离菌能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖，不发酵半乳糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇，硫酸亚铁琼脂试验阳性，M．R．试验、V-P试验、硝酸盐试验阴性。

◆3.4　分离菌 16S RNA PCR扩增结果

以分离菌作为模板，采用细菌 16S 通用引物进行PCR扩增，结果扩增到了预期大小的特异性条带。将扩增产物送长沙擎科生物技术有限公司进行测序分析，将测出序列(登录号为 KX579946)输入NCBI 进行 BLAST 比对，结果发现扩增产物与 GenBank 中登录的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 16S 基因的相似性达到 99%～100%。

◆3.5　毒素因子 PCR扩增结果

以分离菌作为模板，采用细菌 ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ引物进行 PCR扩增，结果 ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅣ扩增到了预期大小的特异性条带，目的条带大小分别为 634 bp、514 bp、358 bp，ApxⅢ没有扩增出目的条带。将扩增产物送擎科生物技术有限公司测序分析，将测出的序列(ApxⅠA 登录号为 KX592543 、ApxⅡCA 登录号为 KX594330、ApxⅣA 登录号为 KX594329)输入 NCBI 进行 BLAST 比对，结果与 GenBank 登录的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA 基因的相似性达到 99%，与 ApxⅡCA 基因相似性达到 100%，与 Apx ⅣA 基因相似性达到96%～99%。

4　讨论

从急性死亡、鼻孔流出血红色泡沫的育肥猪上采集肺脏样本，分离得到大量革兰氏阴性杆菌，且该菌能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖，不发酵半乳糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇，硫酸亚铁琼脂试验阳性，M.R.试验、V-P试验、硝酸盐试验阴性。16S RNA 基因与GenBank 登录的 APP 序列相似性达到 100%，说明分离菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。毒素基因 PCR检测结果表明，该分离菌含有 ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅣ基因。

引起各地猪传染性胸膜肺炎的 APP 的血清型不同，不同的血清型分泌不同的毒力因子，即使是同一血清型菌株在一个地区可能具有典型高毒力，而在另一个地区就呈现低毒力，对宿主产生不同的致病性，因此毒力因子及其基因与血清型存在着密切的关系。Apx 是 APP 的最重要毒力因子之一，采用PCＲ技术检测 APP 中的毒素因子是调查 APP 流行情况的一种简单、高效的方法。

来　　源

《黑龙江畜牧兽医》2017年07期（下）第129-130页《育肥猪传染性胸膜肺炎的诊断及分离菌毒力基因检测》

版权归原作者所有，向原创致敬

责编 | 邰丽萍编辑排版 | 王洁审核 | 朱海虹

作者 | 廖华媛　吕　磊　李润成　余兴龙湖南农业大学动物医学院

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