微流体是在单细胞水平上探测生物学的有力工具。然而，单细胞微流控制技术在病毒学领域的应用时间较短。
基于微孔、微阀和液滴的一系列方法现在可用于跟踪病毒感染动态、识别具有特定类型的细胞亚群以及高通量筛选。
单细胞生物学在过去十年中发展十分迅速。生命科学和医学的许多领域，包括神经科学、免疫学、肿瘤学和药物的发现，都从揭示细胞间异质性和随机性的单细胞分析中受到启发。
由于病毒的生命周期在很大程度上依赖于宿主细胞的生长情况，因此细胞异质性也将反映在病毒感染的不同结果上。
单细胞水平上剖析病毒-宿主相互作用基因表达基本上是随机的，介导病毒进入、激活先天免疫反应和塑造病毒复制细胞间环境的宿主因子的表达也不例外。
除了宿主细胞的异质性之外，输送到每个细胞的单个感染单位也可能彼此存在显著差异。特别是对于许多动物病毒，一个噬菌斑形成单位可能包含数万至数千个病毒颗粒。
此外，RNA病毒以高突变率不断进化，并以病毒准种的形式存在，这是具有不同基因组和感染能力的活性和缺陷病毒变体的混合物。
图1
因此，当病毒感染以低感染多样性(MOI)开始时，将预先存在的病毒多样性引入单个细胞是不可避免的。总之，这些多层异质性预测了细胞间病毒感染结果的变异性。
在单细胞水平上解决这些差异能够识别被批量测定掩盖的真相，以及它们在病毒感染或抗病毒耐药性期间出现的独特作用，从而为阐明抗病毒治疗和疫苗的开发提供了新的机会。
单细胞病毒学的研究通常以微孔板进行，一方面是因为细胞显微操作和连续稀释比较简单、而且成本较低法，但是操作较为繁琐。
另一方面，虽然荧光激活细胞分选(FACS)可以自动将单个细胞送入单个微孔，但需要预先标记而且样品较多。例如，为了绘制病毒RNA动力学的变化，而动力学随机性对单个反应的影响会被多个病毒基因组平均化。
由于在细胞培养条件下直接观察和操作单个病毒粒子仍然充满挑战，因为它们的体积很小，因此此类实验常常通过感染MOIsb0.1的细胞进行随机配对来实施。在这种情况下，样本量（即病毒感染细胞的数量）也进一步减少。
通过小型化和集成实验的开展，微流体具备克服这些缺点的能力。特别是微流体装置的小尺寸显著促进了单细胞生化测定和平行显微镜观察的发展。
微流体装置中单个细胞的大规模捕获已经能够通过已知的机制予以实现，例如介电泳、光镊、流体动力学和声波。将这些方法与病毒学研究结合时，病毒甚至可能在细胞裂解之前就从受感染的细胞中释放出来。
图2
在技术上很难明确区分混合物中的原发感染和继发感染。为了避免在数据处理和分析中增加一层复杂性，在理想情况下，单个细胞和病毒颗粒应分成单独的隔室，在这些隔室中病毒与宿主相互作用而不会发生串扰。
考虑到这一要求，迄今为止大多数相对实用的方法都可以分为基于微孔、阀门和液滴的原理。
病毒感染动力学的动力学分析即使在单细胞分辨率下，通常也会量化感染性病毒颗粒和核酸。在很大程度上，病毒-宿主相互作用本身仍然是一个黑匣子的状态。
细胞具有许多免疫防御功能来限制或限制病毒感染，而病毒已经进化出许多策略来逃避它们。连续地获取单细胞病毒感染的时间信息，可以将特定的细胞和分子特征关联起来。
结合活细胞成像技术，微流控制平台是监测病毒感染动态的理想选择。例如可以使用具有408到765个微流体通道将单个urkatT细胞停靠在阵列中，然后再用GFP基因追踪潜伏的HIV。
虽然这种微流体方法在某些情况下可能有用，但是为了长期监测单细胞中的病毒复制，基于微孔/阀门的设备更适合用来防止受感染细胞之间的影响。
基于微孔的设备最大的特点是比较简单。通常，每孔体积为纳升的微孔阵列由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、硅或玻璃制成。例如，使用2500个长50μm的立方微孔的PDMS阵列，在上面直接加载悬浮的水疱性口炎病毒(VSV)感染细胞，可以通过重力随机沉降。
单细胞微流控技术及其典型应用通过建立一种双色荧光报告系统来跟踪单细胞中病毒与宿主相互作用的动态关系，其中RFP信号表明产生了传染性病毒颗粒，而GFP读数表明细胞先天免疫已经激活。
有了这种用于活细胞成像的荧光报告系统，以全时空分辨率监测阵列细胞，使这种基于微孔的技术在跟踪数千个单细胞规模的病毒感染动态方面具有很大优势。
图3
使用相同的流线型管道，可以定量表征病毒和宿主基因表达的动态动力学，以及它们如何影响VSV感染的结果。
同时，皮尔逊系数也反映出，病毒蛋白的产生与先天免疫反应的开始与增加时间相关，但与幅度无关。更早的病毒基因表达和更慢的抗病毒反应促进了病毒增殖产量的提高。
此外，激活病毒应激反应的单个细胞可能会产生更多的病毒蛋白并更早地裂解。因此推测，这些细胞的抗病毒细胞因子分泌能力得到显著增强，从而“警告”更多邻近细胞作为抑制病毒感染传播的潜在机制。
所以，这项技术更强调病毒感染的单细胞分析在亚群中的鉴定和量化方面更加优于传统的批量检测技术。
比如一种基于阀门的装置，该装置由多个PDMS层组装而成，用于培养感染病毒的单细胞。这些腔室连接到通道，这些通道可能会因为控制层中特定通道的变形而阻塞。
由于PDMS具有弹性的特点，这些气动阀可以通过改变施加在控制层上的压力来自由地切换。然而，这本质上是一个“类微孔”平台，因为阀门仅用于隔离注入微流体通道的病毒感染细胞，其作用类似于微孔上的载玻片盖。
比如，以脊髓灰质炎病毒(PV)-GFP为模型，通过活细胞成像观察24小时内不同细胞周期阶段和病毒基因型的病毒感染情况。
在评估有关感染动力学不同类别的抗病毒药物时，单细胞分析法解释了有关抗病毒混合物的作用机制和协同作用的信息。该技术是前所未有的，因为传统的方法只能提供一种有效性衡量标准。因此，单细胞分析法可能对药物开发的过程产生较大的促进作用。
病毒感染的细胞产生的变异在本质上是mRNA和蛋白质异质性的表现。人们也更加关注利用病毒-宿主相互作用的转录组学分析来探索病毒的多样性和进化过程，可以用来解释响应病毒感染的细胞异质性，特别是识别显示特定类型的细胞亚群。
作为核心要素，单细胞RNA测序(scRNA-seq)已经在不同的平台上得到了运用。然而，该方法高度依赖于手动挑选细胞或用于单细胞分离，存在大量复杂的工作流程。微流体产生的纳升级液滴已成为scRNA-seq的反应器，它具有更高的灵敏度。
而一些基于微孔的设备用于病毒感染单细胞的检测仍然需要复杂的操作，以将不同的试剂分别加载到每个孔中。相比之下，微流体技术的一个特点是它能够逐步完成该工作的全部流程。
通过对在线微型阀的操作进行编程，可以逐步将试剂引导至指定位置。这种高密度微流控制芯片被称为“集成流控电路”(IFC)。
图4
它可以同时处理多达800个细胞，精确控制IFC可以实现在纳升反应体积中自动进行细胞捕获和裂解、逆转录和PCR扩增，然后回收并量化单细胞反应产物。
使用该工具，可以解释单细胞间病毒基因表达的表型异质性，正如使用特定病毒EhV-201的宿主病毒模型系统所证明的那样。基于这种异质性，可以辨别处于不同感染状态的细胞，并说明一种无法识别的宿主反应。
通过检查病毒进入到发育的大脑中单个细胞的受体的表达，可以了解到一个可能导致寨卡病毒(ZIKV)感染神经干细胞的机制。同时，对新皮质和脊髓神经上皮干细胞进行单细胞检测，可以模拟ZIKV相关的神经发病机制。
通过鉴定HIV生物标志物和HIV诱导细胞的134个基因特异性转录特征。说明基于微流控的检测技术在揭示病毒感染过程中的细胞和分子发生机制方面很有作用。
具有特定类型的细胞亚群可能会显着影响病毒感染期间的整体种群行为。识别这些非常罕见的亚群是对阀门系统的挑战，因为它们需要相对较大的物理空间来容纳每个单细胞单元和额外的外围设备来提供驱动力。
在这种情况下，允许吞吐量高几个数量级的液滴微流体技术成了首选。一般来说，单分散的油包水液滴是在具有流动聚焦或T型接头设计的微流体通道中产生的，频率高达每秒数千个。通过采样通道的某些配置，单个细胞和试剂可以一起封装到单个液滴中。
这样便可以获得数百万个独立的微反应器并将其稳定在油中。在细胞封装过程中使用条形码来区分各个液滴中的反应产物，因此液滴可以在破损后进行整体分析。
例如，使用一个开源Drop-seq管道。首先使用微流体流动聚焦几何结构将条形码寡核苷酸与细胞和试剂一起封装在液滴中。然后，单个细胞随后裂解成单个液滴，释放的聚腺苷酸化mRNA被微珠捕获。最后，从液滴中回收带条形码的转录组，用于后续的扩增和测序。
使用该平台对感染单纯疱疹病毒1(HSV-1)的单细胞进行转录分析，可以发现一个罕见的流产感染细胞亚群，是它们启动了“抗病毒程序”。同样，使用相同的技术，在HSV-1感染细胞的一个子集中，转录因子NRF2被激活，这也与抗病毒程序相关。
图5
由此可知，单细胞微流体技术为鉴定关键细胞亚群铺平了道路，这些细胞亚群的类型在批量分析评估时不会表现出来。
在Drop-seq管道中，微珠和用于加载的细胞通常都会被稀释，以最大限度地降低它们各自在液滴中的多重态率。然而，遵循双泊松分布会产生低细胞捕获率，就会在可用样本有限时成为一大阻碍。
为了实现超泊松分布，使可变形粒子紧密堆积的方法是可行的。还可以实现以约80%的填充率将单个凝胶珠封装到液滴中，从而使细胞捕获率提高。
每6分钟的运行可以生成和收集数万个液滴中的单细胞。尽管实验成本较高，但该平台表现出比Drop-seq更好的分子灵敏度和精度，因此得到广泛使用。
比如已经用它来量化ZIKV、HIV、流感病毒、巨细胞病毒(CMV)和人乳头瘤病毒(HPV)感染期间的基因表达。
还有，可以用它定量地揭示A型流感病毒(IAV)感染期间极其广泛的细胞间变异情况，根据感染细胞中病毒mRNA量的分布计算出超过0.64的基尼系数。
虽然这种异质性部分归因于某些受感染细胞中某些病毒基因的缺失，但其他病毒和宿主因素的影响也不容忽视。
在此基础上，可以使用将转录组学分析和单细胞中所有病毒基因的全长测序相结合的方法。
因此，IAV的病毒遗传变异被称为病毒感染细胞中先天免疫激活的异质性来源。
尽管在大多数病毒粒子中发现了多种免疫刺激缺陷，但仍然存在与病毒基因型无关的随即感染结果。因此，不能仅通过干扰因素诱导的病毒遗传缺陷诱导对流感病毒感染的先天免疫反应，这也再次表明有必要在单细胞分辨率下研究病毒感染。
Drop-seq和10XGenomics技术的局限性在于只能量化mRNA转录本。通过单细胞测序(DART-seq)进行的液滴辅助RNA靶向，这是对Drop-seq技术的简单改变，有望在单细胞中同时进行多重RNA扩增子测序和转录组学分析。
可以通过将具有不同序列的定制引物附加到Drop-seq珠子上的序列子集来实现。比如使用呼肠孤病毒作为模型，说明DART-seq除了捕获单细胞中的转录组外，还能够捕获多个非聚腺苷酸化的转录本。
人们努力地获取更多的多维数据，这样就能更全面地分析病毒与宿主的相互作用。例如，为了从scRNA-seq数据中提取具有生物学意义的信息，应该建立特定表型和特定转录特征之间的存在的关联。
通常，细胞表型是通过群体水平的蛋白质表达和活性来评估的。更直接的方法就是表征表型和每个单细胞的转录组。
为了完成这样的多组学分析工作流程，基于阀的微流体系统具有更好的应用前景，因为它们能够高度集成复杂的实验程序，从细胞加载到生化刺激、洗涤、
以高度可控和互不不干涉的方式进行细胞裂解和裂解物回收。
比如，在微流控制室中划分的多达144个单细胞中超灵敏地定量蛋白质和mRNA，在单细胞中探索HSV-1是如何感染的。
将表达被感染细胞多肽4-黄色荧光蛋白(ICP4-YFP)的HSV-1菌株加载到设备上感染A549细胞，通过延时成像监测，并裂解以测定HSV-1病毒蛋白。不出所料，由于ICP4在病毒基因表达调控中的重要作用，在这些阳性细胞中发现了更高浓度的病毒蛋白。
根据病毒准种理论，批量实施的感染实验应该由主要等位基因主导。研究这些次要等位基因的唯一方法是在没有竞争的情况下，分离出数千甚至数百万个被单个病毒粒子感染的单细胞。
液滴微流控制平台以高通量单细胞分析和筛选作用被大家熟知，为发现极其罕见的生物标志物提供了另一种实现的可能。比如用一种流动聚焦系统，可将小鼠诺如病毒(MNV-1)和单个RAW264.7细胞包封在体积为65pL的液滴中。
将病毒颗粒稀释后，在中和性单克隆抗体存在的条件下感染细胞。24小时后检测到的感染性颗粒约占基因组拷贝的一半，这比用标准体积实验得到的分数高得多。
因此，在这种条件下，能够逃避进化压力源的病毒变异可以被有效地分离出来。该平台为病毒准种小等位基因的分离和分析提供了一种高通量和低成本的工具，还可应用到筛选方面。
使用被动流微流体装置，观察到响应LRA的HIV再激活。通过将单个细胞置于同一个微通道中，可以跟踪激活细胞中HIV-GFP的表达，但量化与每个细胞相关的HIV RNA的数量或者将细胞分选出来进行下游更进一步的表征却不太实际。
为了解决这一问题，可以使用微流控制装置对潜伏感染HIV的淋巴细胞进行包封。与用于聚腺苷化mRNA分析相比，这种具有成本效益的方法也允许荧光检测未剪接的RNA和多剪接的RNA使用HIV RNA进行PCR扩增。
因此，HIV转录再激活细胞可以筛选出人类gDNA和mRNA的特征。将该方法应用于从接受治疗的参与者中分离的T细胞抗逆转录病毒治疗表明，当在单细胞水平评估HIV再激活时，LRAs可能会增强活性细胞的转录或增加转录活性细胞的数量。
本技术面临的问题和未来的改进不言而喻，单细胞病毒学在很大程度上还是一个未知的领域。即使使用单细胞微流体作为一种变革性工具来增加对病毒-宿主相互作用的分子和细胞基础的理解，实际上通过传统的群体规模实验是无法实现的。
除了微流体，计算生物学方法和单细胞测序技术的可用性也推动了这一领域的快速发展，单细胞病毒学发展的新时代才刚刚开始。
病毒感染的动力学分析是通过不间断的微流体培养和单细胞成像开展的。追踪到的成分越多，分子网络就越深入，从而剖析病毒与宿主的相互作用。
然而，在转录组学分析中，不应低估批次效应对观察到的细胞间表达变异性的影响，这是所有scRNA-seq技术面临的共同问题。从技术角度来看，减少这种影响的解决方案是增加一次处理的样品数量。
理想的微流控制技术还可以实现高通量分析和多参数测量，不幸的是，这两种能力通常相互矛盾。另一个原因是，针对不同的分析物进行分析，尤其是在多个时间点进行检测，将不可避免地推动微流控制装置的整体设计、功能元件的集成和自动化操作向更复杂的方向发展。
另一个重点是“复杂”的系统，有可能进行多参数测量，这将需要工程师和病毒学家之间更紧密的合作，以确定特定的分析目标，并相应地确定检测开发的路线图。
虽然这些高度个性化的微流体装置的开发和操作通常由熟练的用户进行，这在某种程度上阻碍了病毒学实验室的广泛普及，但它们可以为回答该领域前沿问题的人提供更多机会。
在我们看来，确保这些平台能够广泛实施的另一个问题不是微流控制技术，而在于数据处理和分析方法。考虑到独特的病毒学问题，通常规模巨大的单细胞数据集在质量或格式上存在差异，因此需要通过各种定制的计算模型和工具进行处理。
