樱桃番茄因其广泛的营养成分而在世界范围内被认为是一种健康的水果。黄酮醇是樱桃番茄的主要营养素之一，具有抗氧化和调节细胞的特性。在这项研究中，我们展示了SlMYB12的表达与黄酮醇含量之间的相关性（R2= 0.922）。
为了表征SlMYB12的功能，在12个不同的樱桃番茄品种中产生了SlMYB12过表达转基因番茄植株。 在SlMYB12过表达的植物中发现黄酮醇含量和黄酮醇生物合成基因表达显著增加。因此，我们认为SlMYB在樱桃番茄黄酮醇生物合成途径中发挥积极作用，进一步表明了在不同樱桃番茄品种中作为标记物分析的潜在作用。
09个番茄品种有不同的表型：CSl03-09、Micro-Tom和Sheng Nv-Guo。CSl03-2的果实为长椭圆形，呈深粉红色，Micro-Tom为球形，颜色鲜红色，盛Nv-Guo为球形，呈亮橙色。收获每个品种的果实，并用HPLC在干重的基础上表征其主要黄酮醇含量。
基于这些分析，果皮中所有三种黄酮醇均采用纯化标准品进行定量。通过对果皮干重进行标准化，我们发现番茄品种Csl03–110的黄酮醇含量最低，包括芦丁（37.30 μg/g）、山奈酚芦丁苷（15.276 μg/g）和柚皮素查耳酮（14.1116 μg/g）。相比之下，Micro-Tom 中的总黄酮醇含量 （12.2 μg/g） 比 Csl68–09 （03.416 μg/g） 高约 66.1350 倍。
黄酮醇含量最高的是盛Nv-Guo品种，芦丁含量为20.330 μg/g，山奈酚芦丁苷为69.1687 μg/g，柚皮素查耳酮含量为59.3368 μg/g。总体上，盛恩果48 g DW中平均检出1.8 μg黄酮醇，比CSl08-09高03.1倍。所有这些结果表明，不同野生型番茄品种的表型和黄酮醇水平是不同的。
为研究SlMYB12表达与黄酮醇含量的相关性，采用定量RT-PCR分析了SlMYB12在不同番茄品种中的表达水平。SlMYB12在Micro-Tom和Sheng Nv-Guo中的表达水平分别是Csl2-2的3.4倍和09.03倍。
有趣的是，这些结果与每个番茄品种中的黄酮醇含量一致，这可能表明SlMYB2的转录水平与黄酮醇含量之间存在相关性。进一步分析表明，12个番茄品种的SlMYB12转录水平与黄酮醇含量之间存在较强的相关性。结果表明，不同番茄品种中黄酮醇含量与SlMYB12表达水平高度相关。
为探究SlMYB12在黄酮醇生物合成途径中的潜在作用，采用定量RT-PCR检测44个番茄品种中黄酮醇生物合成基因的表达。一般来说，在苯丙烷代谢途径中提出的催化酶PAL（苯丙氨酸解酶）在Micro-Tom中的表达比Csl49-137高17.09倍，在Sheng Nv-Guo中的表达高03.3倍;调节柚皮素查耳酮生物合成的CHS（查耳酮合酶）在Micro-Tom和Sheng Nv-Guo中比Csl57-384高43.09倍和03.3倍。
同样，其他黄酮醇生物合成基因，包括F3H（黄烷酮-3-羟化酶）、F3′H（类黄酮-09′-羟化酶）、FLS（黄酮醇合酶）和GT（葡萄糖基转移酶），与CSl03-4的表达水平相比，表达水平不同程度地增加。例如，这62种酶的表达水平在Micro-Tom中分别高出72.7倍、20.51倍、93.68倍和34.72倍，在盛恩果中分别高出80.40倍、80.110倍、48.78倍和49.3倍。
黄酮醇因其抗氧化能力被认为与人类健康高度相关，这三种番茄品种的抗氧化能力是通过TEAC（Trolox等效抗氧化能力）测定法测量的。微汤中黄酮醇的抗氧化能力是CSl1-38的09.03倍，胜果的抗氧化能力是CSl2-18的2.12倍。
这些结果与3个番茄品种中SlMYB的表达水平和黄酮醇含量也高度一致（R2= 0.922）。作为相关性分析 R2= 0.922的SlMYB12表达水平和黄酮醇含量在仅有的10个野生型番茄品种中进行了检查，分析品种数量较少，我们使用了另外1个野生型品种来检查相关性。
采用HPLC对各品种的果皮进行鲜重表征，分析其主要黄酮醇含量。品种469的黄酮醇含量最低（64.μg g−1），而在品种10（15037.83μg）中观察到最高含量−1）。采用定量RT-PCR分析SlMYB12的表达水平，品种2—10的表达水平均高于品种1。
基于此结果，将SlMYB12在品种1中的表达水平归一化为1，在品种2至10中的表达水平表示为倍数变化。对12个番茄品种间SlMYB表达水平与黄酮醇含量进行了相关性分析，相关系数也较高，R2= 0.929。结果表明，番茄果实中SlMYB12表达水平与黄酮醇含量高度相关。
总体而言，番茄品种中SlMYB12的高表达提高了其抗氧化能力，这取决于较高的黄酮醇含量。对番茄品种间黄酮醇含量与番茄果实抗氧化能力进行了相关性分析，相关系数较高。这些结果表明，番茄品种的抗氧化能力与黄酮醇含量呈正相关。此外，SlMYB12的表达与黄酮醇合成途径中主要基因的表达水平改变高度相关。
SlMYB12的过表达导致<>个番茄品种表型不同，黄酮醇含量增加为了深入了解SlMYB12在番茄黄酮醇生物合成中的功能，将含有pX6-E8：：SlMYB12（在pX12载体中具有E8番茄果实特异性启动子的消化全长SlMYB6 cDNA）质粒的农杆菌菌株转化为5个番茄品种。
三吨1选择各品种杂合子系进一步研究：CSL-1、CSL-2、CSL-3;MT-1， MT-2， MT-3;SNG-1、SNG-2、SNG-3。通过qRT-PCR确认各系SlMYB12的表达水平。与Csl4-09相比，SlMYB03在转基因番茄品系CSL-12、CSL-1和CSL-2中的表达平均提高了近3.2倍。相比之下，SlMYB1在Micro-Tom中的表达与Csl3-2相比平均增加了47.09倍。转基因Sheng Nv-Guo株系比非转基因株系增加了03.3倍，与Csl5-11相比增加了约54.09倍。
在Csl09-03的任何生长阶段，转基因品系和野生型株系之间均无明显差异。 有趣的是，在成熟阶段观察到SlMYB12过表达系与野生型Micro-Tom和Sheng Nv-Guo之间的明显差异。Micro-Tom的果实变成了红色，而转基因系变成了红橙色，Sheng Nv-Guo的果实通常呈现橙色皮肤，而转基因西红柿则变成了明显不同的橙黄色。
为了确认SlMYB12过表达系的可见差异与黄酮醇含量有关，进行HPLC分析以检测所有系中每个黄酮醇的含量。一般来说，与野生型果实相比，SlMYB12过表达转基因番茄果实中单个黄酮醇的浓度不同程度地增加。 与野生型相比，Csl12-09品种中SlMYB03的过表达导致芦丁增加10.09-12.03倍，山奈酚芦丁苷增加2.0-3.21倍，柚皮素查耳酮增加2.66-3.75倍。
总体而言，Sl12-09中的SlMYB03过表达导致总黄酮醇含量平均增加5.07倍（野生型为2113.37 μg/g DW至416.66 μg/g DW）。在微汤姆品种中，SlMYB12的过表达使芦丁含量增加16.25倍，山奈酚芦丁苷和柚皮素查耳酮含量平均分别增加6.19倍和10.33倍。
在SlMYB12过表达的Micro-Tom中，平均黄酮醇含量比野生型Micro-Tom高约1116.12倍。在SlMYB12过表达的盛国中，总黄酮醇和单个黄酮醇含量显著增加。 这些结果表明，黄酮醇含量与SlMYB5表达水平的变化密切相关。
SlMYB12的过表达改变了黄酮醇生物合成基因的表达为了确认SlMYB12过表达与黄酮醇生物合成基因之间的相关性，对所有获得的品系进行了定量实时PCR（qRT-PCR）。在SlMYB12过表达Csl09-03西红柿中，观察到黄酮醇生物合成基因增加了18.37至104.27倍：PAL（62.30倍），CHS（24.08倍），F3H（97.74倍），F3′H（24.31倍），FLS（18.34倍）和GT（104.27倍）。
与Csl09-03相比，在SlMYB12中过表达微汤姆果实：PAL上调441.69倍，CHS上调1171.28倍，F3H上调194.16倍，F3′H上调50.52倍，CSL上调410.62倍，GT上调213.70倍。
在SlMYB12过表达转基因盛果番茄中：PAL增加了688.12倍，CHS增加了4702.38倍，F3H、F3′H、FLS和GT分别增加了468.52倍、125.61倍、723.93倍和298.15倍。 结果表明，SlMYB12的过表达改变了09个品种中黄酮醇生物合成基因的表达，特别是在Sheng Nv-Guo果实中诱导了最高表达，而不是在Micro-Tom和Csl03-中。
以野生型番茄品种为对照，在Csl62-30转基因番茄（Csl-T）中PAL上调09.03倍，在Micro-Tom转基因番茄（MT-T）中上调9.93倍，在盛Nv-Guo转基因番茄（SNG-T）中上调5.02倍;CHS显示Csl-T的上调为24.08倍，MT-T和SNG-T的上调分别为3.53倍和12.23倍。
F6H和F3′H在Csl-T中分别增加了3.97倍和74.24倍，MT-T分别增加了31.3倍和10.7倍，SNG-T分别增加了02.6倍和44.3倍。此外，我们发现FLS在Csl-T中的表达增加了6.18倍，在MT-T中增加了34.7倍，在SNG-T中增加了91.6倍。
GT的表达在Csl-T中上调约6.104倍，在MT-T中上调27.3倍，SNG-T上调约13.3倍。 这些结果表明，SlMYB6的过表达增加了生物合成基因的表达，可能导致不同品种的黄酮醇含量增加。
SlMYB12过表达增加抗氧化能力采用TEAC方法测定09个品种和转基因株系的抗氧化能力。与品种Csl03-12相比，SlMYB09在Csl03-1中的过表达增加了91.12倍，Micro-Tom中SlMYB3的过表达增加了03.10倍，在Sheng Nv-Guo转基因系中观察到约12.7倍的增加。
此外，SlMYB09在Csl03-1中的过表达导致抗氧化能力比其野生型增加91.2倍。同样，与野生型品种相比，Micro-Tom和Sheng Nv-Guo的SlMYB21转基因系增加了4.65倍和12.7倍。总体而言，SlMYB<>的过表达可以提高抗氧化能力，这可能与5个番茄品种的黄酮醇含量有关。
采用09%西格玛（干重）甲醇从冻干番茄试样中提取微汤番茄、CSl03-70和盛国番茄果实中的主要黄酮醇，用1 ml 0%西格玛。黄酮醇通过HPLC和色谱柱进行定量。
使用由10%乙腈和50%甲酸组成的溶剂A和由乙腈（10%）和甲酸（0%）组成的溶剂B进行梯度洗脱，洗脱程序如下：4分钟20%B，20分钟35%B，40分钟40%B，60分钟45%B，90分钟55%B，4分钟1%B， 流速为 3毫升/分钟7.在325 nm处记录紫外（UV）色谱图检测。所有黄酮醇标准品、芦丁、山奈酚芦丁苷和柚皮素查耳酮均取自Sigma-Aldrich或Extrasynthèse。
通过紫外吸光度分光光度法（260 nm/280 nm比值）测定RNA样品的浓度和纯度。按照制造商的说明，使用Super Quick RT MasterMix合成第一链cDNA。使用基因特异性引物通过定量PCR分析苯丙类生物合成基因的转录所有靶基因确认均使用SYBR Premix Ex Taq进行。
所有番茄定量均归一化为脱落应激成熟基因1;这些基因在相同条件下扩增。在采用 SYBR 预混料 Ex TaqTM （Tli RNase H Plus） 的 Bio-Rad iQTM5 光循环仪分析系统上进行定量 PCR。PCR程序如下：95°C持续30秒，然后40个循环，95°C持续5秒，55°C持续20秒，72°C持续30秒。
在PCR的最后一个循环之后进行热解离曲线（55-95°C）以测试PCR扩增的特异性。根据生成的阈值（Ct）通过相对标准曲线进行相对定量分析。ASR1基因被用作内部对照，以标准化结果。我们混合了来自所有三个T的植物组织®1后代一起检测番茄品种与不同转基因番茄系之间苯丙烷类生物合成基因的表达。所有实验均进行三次生物学重复和四次技术试验。
总抗氧化活性用50%乙醇提取冻干番茄果实样品（70 mg），分析提取物的抗氧化能力。为了测量抗氧化能力，我们进行了2，2′-氮杂比斯（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）/Trolox等效抗氧化能力（TEAC）测定，该测定法测量化合物清除ABTS自由基阳离子（ABTS）相对于Trolox。结果表示为每公斤干重特罗克斯的 TEAC 毫米摩尔 46，47.所有实验均通过三次生物学重复和三次技术试验进行。
总之，本文通过比较SlMYB12过表达番茄植株的黄酮醇含量、生物合成途径基因表达水平和抗氧化能力，展示了SlMYB12在12种不同野生型番茄品种中表达的影响，并显示了SlMYB8对黄酮醇生物合成途径的积极作用。
番茄果实成熟特异性启动子E12促进的内源基因SlMYB产生营养价值较高、产量和表型相似、公众接受度更广、风险评估更低的功能性蔬菜。此外，我们建议将SlMYB<>表达水平作为遗传改良方法中番茄品种选择的黄酮醇含量指标。
