美国FDA的研究人员在两头基因编辑无角牛的目标位点附近，检测到了一段含有外源细菌DNA序列的插入突变，这一发现给此前备受期待的基因编辑动物的产业化前景蒙上了阴影。
世界上首批基因编辑无角牛没能通过FDA的审核。 （recombinetics.com网站/图）
2019年7月底，美国食品药品监督管理局（FDA）的研究人员在国际生物论文预印网站BioRxiv贴出一篇未经同行评议的论文，曝出基因编辑无角牛的基因组中意外地插入了一段细菌DNA，给这此前备受期待的基因编辑动物的产业化前景蒙上了一层阴影。在此之前，很多专家和媒体曾预测该基因编辑无角牛有望成为世界上首个获准上市的基因编辑动物。
备受期待的无角牛
基因编辑无角牛是美国Recombinetics公司2016年完成的一项研究成果。美国Recombinetics公司由明尼苏达大学动物遗传学教授斯科特·法伦克鲁格（Scott Fahrenkrug）在2008年创立，一直致力于研发基因编辑大动物。2016年，该公司的首席科学官丹尼尔·卡尔森（Daniel F Carlson）作为第一作者，在著名的《自然·生物技术》杂志上公布了他们培育两头基因编辑无角牛的过程。
在自然界里，牛角是公牛的防御武器，在现代养牛业中却成为了“凶器”，会对其它牛只和饲养人员造成潜在伤害，所以规模化养牛场一般采取电锯、电烙等物理方法给牛犊去角。在美国，每年需要去角的奶牛约有480万头，肉牛则有875万头。这些物理去角的方法既增加了养殖成本，也可能给牛只造成感染、应激等意外伤害，因此去角成为动物保护组织反对的对象。
由于基因突变，有些牛天生不长角。育种学家也利用这些自然存在的无角性状培育出无角牛，如美国最著名的肉牛品种安格斯牛就是无角牛。但是，无角性状在荷斯坦奶牛群体中只约占6%，如果用传统杂交育种的方法，即使不考虑奶产量等性状遗传进展提高缓慢所造成的经济损失，也需要花费20年以上的时间才能让无角奶牛占到美国奶牛群体的一半。原来在控制牛角生长的一个基因位点上，无角牛含有一段202个碱基对的DNA重复序列，而有角牛的相同位点只有10个碱基对，于是卡尔森等人采用基因编辑技术——转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）技术，将天然无角牛身上的无角基因突变序列，引入到荷斯坦公牛细胞内，即用长度为202个碱基对的DNA序列替代了原有的10个碱基对，再通过体细胞克隆技术，培育出两头天生无角的基因编辑无角公牛。卡尔森等人在论文中提到，他们在这些基因编辑无角牛基因组中并没有检测到脱靶现象，也没有检测到插入突变。
Recombinetics公司原本对基因编辑无角牛寄予厚望。2018年5月底，该公司宣布将与加拿大一家育种公司合作，计划用基因编辑无角公牛的精液，繁育更多的基因编辑无牛角，同时也与阿根廷一家公司签订合作协议，计划开拓阿根廷的肉牛市场。除了基因编辑无角牛，Recombinetics公司还培育了没有尾巴和无需阉割去势的基因编辑猪、抗肺结核的基因编辑奶牛等农业动物。另外，该公司也致力于开发模拟癌症、致命遗传病等人类疾病的基因工程猪，该公司开发的人类胶质母细胞瘤基因工程猪模型已获得美国国立卫生研究院的经费资助。
Recombinetics公司正日益发展成为全球基因编辑大动物的领导者，三个月后，2018年8月，该公司在投资市场获得了3400万美元的A轮融资，表明该公司的基因编辑大动物业务受到市场的青睐。据相关咨询机构预测，到2025年，全球基因编辑市场价值将达到81亿美元，美国政府也加大了对基因编辑技术的支持力度，未来5年，美国国立卫生研究院对基因编辑研究项目的资助经费将高达8600万美元。
混入外源DNA
在基因编辑无角公牛培育成功不久，Recombinetics公司即向美国FDA提交实质等同性评价申请，即希望证明该公司培育的基因编辑无角牛与天然的无角牛一样，不存在安全风险，因为他们提供的资料显示，该基因编辑无角牛只是引入了天然存在的基因突变，没有发生脱靶效应，也不存在“基因插入”。美国FDA兽药中心的亚历克西斯·诺里斯（Alexis Norris）等人随即对基因编辑无角牛进行全基因组分析，确认无角牛基因组的目标位点的确发生了预期的基因编辑，即将无角基因特异序列引入到荷斯坦奶牛基因组中，也没有发现脱靶现象。但是令人意外的是，研究人员在两头基因编辑无角牛的目标位点附近，均检测到了一段含有模板DNA序列的插入突变。
原来Recombinetics公司在制备基因编辑无角牛的细胞时，除了要用到基因编辑工具酶TALENs，还需要一个含有无角基因DNA序列的模板载体。TALENs核酸酶经过人工改造，含有一个识别结构域和一个剪切结构域，前者负责在基因组中搜寻目标位点，后者则能将目标位点的DNA双链断开，再通过细胞自有的同源*机制，切除目标位点的DNA序列或者引入所需要的DNA序列，引入外来的序列则需要一段模板DNA。
Recombinetics公司在设计这段模板DNA时，加入了一段来自细菌的DNA，包括具有抗生素抗性的DNA序列。外源DNA一旦进入奶牛细胞核中，就有可能趁虚而入，混入奶牛基因组中。因为对于细胞来说，不管是外来的DNA，还是自身的DNA，都很难区分开，所以只能“一视同仁”，这也是我们人类基因组含有约2亿个碱基对病毒基因序列的原因之一。细胞本身具有针对DNA突变的修复机制，不过那些片段较小的外来DNA或者不对细胞造成威胁的外来基因插入，极有可能蒙混过关。因此，一般在制备基因编辑无角牛细胞时，都需要对其进行全基因组范围内的细菌DNA检测，以排除细菌DNA的整合。这一检测方法并不复杂，只需要常规的PCR等检测技术即可。
至于为什么这段细菌DNA混入基因编辑无角牛基因组中没被发现，诺里斯等人推测可能是Recombinetics公司并没有对基因编辑无角牛进行这段细菌DNA进行检测，或者由于检测方法不灵敏，未能检测到这段细菌DNA。诺里斯等人发现在基因编辑位点附近的重复序列太多，进行PCR检测和测序难度较大，可能是导致检测失败的原因之一。当他们改进了检测方法之后，成功检测出这一意外插入突变，这些方法包括优化过的长片段PCR、定量PCR、长片段测序等，这些方法也有可能用于其它基因编辑动物的检测中，以提高检测的准确度。
不过，这段意外的细菌DNA插入并不会对基因编辑无角牛的安全性造成影响，因为这些细菌DNA在之前美国FDA批准的转基因作物中并不少见，更关键的是，这一意外插入突变只发生在基因编辑无角牛目标位点的一个等位基因，另一个等位基因则属于正确的基因编辑。也就是说，通过与非基因编辑奶牛进行杂交，即可将这两个等位基因分离，获得不含细菌DNA插入的基因编辑无角牛。
放宽无望，逃之夭夭？
对于基因编辑动植物如何监管，政府、科学家和研究机构之间还存在较大意见分歧，即使不同政府部门也有不同意见。
据《自然》杂志报道，2016年4月，美国农业部在回答是否对一种抗褐变基因编辑蘑菇进行监管时，首次表示将不对类似的基因编辑作物进行监管。2018年4月，美国农业部部长再次强调，美国农业部将不会对基因编辑作物像转基因作物一样实施监管。但是，基因编辑动物仍然归美国FDA监管。2017年1月，美国FDA发布了一份关于遗传修饰动物的监管指南草案，计划对基因编辑动物实施较为严格的强制监管措施，而且与制药用途的转基因动物监管措施类似，而监管的责任主体正是此次曝出基因编辑无角牛存在问题的兽药中心。
有分析表示，这一举措将扼*基因编辑动物研发者的积极性。虽然美国FDA目前已经批准了三种生产*蛋白药物的转基因动物，但是对其它用途的转基因动物或基因修饰动物也采用类似监管措施，将阻碍基因修饰动物的产业化进程。2015年11月，美国FDA历经15年漫长而严格的评估，最终才批准快速生长型转基因大西洋鲑鱼可在美国上市，但是也设置了其它障碍。目前为止，这一世界上首个食用的转基因动物产品已在加拿大实现小规模销售，但是仍然没有在美国市场上销售。对此，Recombinetics公司创始人斯科特·法伦克鲁格教授曾对媒体表示，他担心美国FDA的过度监管可能扼*基因编辑动物产业，也将扼*像Recombinetics公司这种创新型小企业。
Recombinetics公司也一直与美国FDA沟通，希望后者向美国农业部学习，放宽对基因编辑动植物的监管尺度。不过，这次在基因编辑无角基因组中检测到细菌抗性基因，美国FDA更有理由对基因编辑动物采取更严格的监管了。如果是这样，将使得基因编辑动物研发成本和时间大幅增加，基因编辑无角牛的产业化也将遥遥无期。
避免监管雷区，前往监管相对灵活的国家发展，或许是基因编辑无角牛突围的途径之一。相对而言，阿根廷、巴西、加拿大等国对于基因编辑动物则要积极得多。2015年，阿根廷出台监管指南，对没有引入外源基因的基因编辑生物实施简化的监管程序。2018年10月，巴西国家生物技术安全委员会确定基因编辑的无角牛是传统动物，这些奶牛及其产品可以进入巴西市场。这或许正是Recombinetics公司与加拿大、阿根廷等国家的公司合作的原因之一。
南方周末特约撰稿 汤波
