景观基因组学：自然选择推动企鹅有丝分裂基因组的进化

我们鉴定了几种企鹅物种的完整mtDNA基因组，包括轻链上的ND6和8个tRNA，以及位于重链上的12个蛋白质编码基因，14个tRNA和两个rRNA。

NADH脱氢酶基因的多样性最高，COX基因的多样性最低。物种间进化差异最低的是洪堡企鹅和加拉帕戈斯企鹅（0.004），而小企鹅和阿德利企鹅（0.097）的进化差异最高。

我们在线粒体基因组中发现了纯化选择的特征（Ka / Ks < 1），这与纯化选择限制有丝分裂基因组进化以维持氧化磷酸化（OXPHOS）蛋白和功能的假设一致。

密码子位点选择的成对物种最大似然分析表明，所有企鹅的ATP8（固定效应似然，FEL）和ND4（单似然祖先计数，SLAC）都发生了正选择。

相比之下，COX1具有强烈的负选择特征。ND4Ka/Ks比值与SST高度相关（Mantel，p值：0.0001;GLM，p值：0.00001），因此可能与整个企鹅物种形成过程中的气候适应有关。

线粒体基因组（mtDNA）处于连续选择状态，因为13个蛋白质编码基因产生的多肽产物与参与氧化磷酸化（OXPHOS）的蛋白质复合物的核编码亚基相关。已经提出了三种类型的假设来解释有丝分裂基因组进化：1）线粒体OXPHOS同时产生能量和热量。

环境温度在ATP产生和热量之间施加选择性权衡饥饿的风险与食物供应受限有关，因为饥饿可以通过OXPHOS途径产生更有效的能量产生耦合最近对病原体的免疫应答的假设。

因此，叶绿素（Chl）作为初级生产力和海面温度（SST）的衡量标准，是海洋生物的重要环境变量，与OXPHOS的效率直接相关，并且与理解mtDNA基因选择模式有关。由于OXPHOS是细胞呼吸的终末阶段，这一过程的破坏对单个细胞将是致命的，如果它广泛发生在个体中，它将对其适应性产生不利影响。

因此，线粒体基因组一方面在连续纯化选择（或负选择）下进化，从而消除种群中的有害变异，而另一方面，极端温度环境中的有益变异可能处于正选择之下，在种群或物种中的频率增加。选择可能在类似环境中的物种之间相似地运作，或者它可能驱动不同基因的适应。

企鹅栖息在南半球从热带到南极极极端寒冷的广泛纬度分布。虽然所有企鹅物种都可以在寒冷、营养丰富的水中（包括在加拉帕戈斯群岛繁殖的企鹅）中在海上生活和觅食，但它们在不同的气候条件下在陆地上繁殖。

最北端的物种是加拉帕戈斯企鹅，而分布最南端的物种阿德利企鹅和帝企鹅在南极辐合（极地锋）以南的南极繁殖。帝企鹅在南极冬季在稳定的流冰上繁殖，气温定期下降到-50°C。

由于企鹅的进化、物种形成和灭绝与历史气候变化密切相关，企鹅的广泛分布，包括不同和极端的气候条件，为识别与这些气候条件相关的分子遗传模式提供了独特的机会。

从所有企鹅的血液样本中分离基因组DNA，并使用盐法保存在乙醇中[53]。对来自三个物种中六个个体的DNA进行了定量，并使用Invitrogen的PicoGreen®检测试剂盒（荧光测定法）进行了质量检查。ABISOLiD™ 5500 XL中的基因组测序在下一代测序机构Omics Solution进行。

DNA脱盐，然后使用标准EtOH /乙酸钠沉淀在20°C下浓缩2小时，然后进行两次70%EtOH洗涤。然后，按照基因组DNA片段文库的ABI SOLiD测序标准方案，将混合的DNA重新溶解在低TE中。DNA样品在Covaris™S220系统中剪切，该系统通过超声处理将输入DNA片段化为平均大小为160 bp的小片段。

颜色空间读取（di-base编码）与LifeScope™（应用生物系统）对齐，使用P. adeliae 的基因组组装作为参考。参考文献被转换为色彩空间，目的是映射读取。颜色空间读取有助于提高每个碱基调用的质量，因为在排序步骤中读取每个碱基两次。

共识序列是根据上一步获得的二进制对齐映射 （BAM） 文件构建的。我们使用SAMtools来获取映射到每个位置的所有碱基，使用BCF工具获得每个位置最可能的基因型，并使用VCF工具以FASTQ格式构建共识序列。然后将FASTQ文件转换为SEQTK的FASTA。

线粒体基因组是用Life Technologies开发的Denovo2管道组装的，使用Velvet汇编器版本1.2.09 在颜色空间模式下组装。ASiD（SOLiD的装配助手）用于填充形成支架的重叠群之间的间隙，并为最终装配执行颜色空间到基空间的转换。

使用Sequencher软件5.1（Gene Codes Corp.，MI）从每只企鹅的重叠群中选择单个基因，并通过与先前发表的企鹅有丝分裂基因组基因的同源性进行注释。由于巴布亚假单胞菌的一个个体的读取次数很少，该个体未包括在数据分析中。所有11个有丝分裂基因组均提交给GenBank。

使用Sequencher v. 5.1目视检查色谱图，对序列进行比对，并确认多态位点。（基因密码，安娜堡，密歇根州，美国）和多个比对是使用ClustalX v. 2.1完成的。对于种间数据分析，我们将56个mtDNA基因组与其他四个企鹅基因组进行了比较：从南非夸祖鲁-纳塔尔省获得的S. demersus（非洲企鹅），从新西兰尼尔森获得的E. minor （小蓝企鹅），E. chrysocome（跳岩企鹅）和A. forsteri（帝企鹅）。

使用DNAsp v. 5估计了来自完整mtDNA的所有13个蛋白质编码基因的插入缺失体数量，多态位点（S），核苷酸多样性（π），同义突变率（Ks），非同义突变率（Ka）和Ka / Ks（或ω）比值。对于基因（如Ka/Ks）的阅读框的分析，只有ND3基因被认为是Mindell等人描述的不同阅读框。

所有Ka和Ks估计值以及相应的比率都是在蝶属和Pygoscelis属内以及所有五个属之间的成对物种之间获得的。由于我们对Spheniscus和Pygoscelis属的几个物种进行了测序，因此属之间的值是成对物种Ka和Ks值的平均值，用于属比较。

我们还使用最大似然模型和 R 包中的 Arlequin 软件 和 Arlequin 软件 计算了这里研究的所有 06 只企鹅（61 种）之间所有 62 个连接基因的 mtDNA 基因组的成对距离。所有包含差距的职位都被消除，最终数据集中总共剩下63，64个职位。

季节性叶绿素浓度（Chl）和海面温度（SST）来自基于9×9 km空间分辨率的海景宽视场传感器（SeaWiFS）和中分辨率成像光谱仪（MODIS-Aqua）全球季节性数据库。标准的SeaWiFS叶绿素产品，ChlOC4，基于经验最大带比算法进行估计，该算法使用443、490、510和555 nm处的遥感反射率测量值。

该算法将三个遥感反射率波段比（443/555、490/555 和 510/555）的最大值与海洋叶绿素浓度的现场测量值相关联SST 基于 MODIS 校准的中红外和远红外辐射 （IR），使用利用不同 IR 波段大气透射率差异的算法估计。

SST数据的可靠性得益于其与海洋学巡航和当地站点测量的海面温度的高度相关性，在较高温度下略有正偏差。在这里，我们使用 Chl 和 SST 作为每个企鹅物种分布范围内的环境条件的代理。

实施Mantel测试和GLM模型（广义线性模型）来探索遗传参数（π和ka/ks）与环境参数（Chl，SST和COM）的距离矩阵之间的关系作为解释变量。为了研究遗传模式与环境参数（Chl，SST和COM维度的距离）之间的关系，将Mantel矩阵距离分为三个子矩阵，每个子矩阵描述Chl，SST和COM距离有界区间内物种对之间的模式。

这些有界区间包括 a对应于最小值到 33% 的数据距离的短成对距离，b） 对应于数据距离的 33% 到 66% 之间的成对距离的中间距离，c） 由最大的 33% 成对距离组成的大距离和 d） 所有成对数据。

对于 Mantel 检验，p 只基于 10，000 次模拟获得。数据的正态性（Ka/Ks 和 π）应用夏皮罗-威尔克检验进行测试。计算GLMs的p值和AIC考虑了正态分布下所有数据的高斯误差结构和无正态分布数据的伽马误差结构。所有统计分析均使用R包实施。

12个基因组中每个基因组的读取次数从52，990，428到158，565，602不等。巴布亚假单胞菌的一只个体因读取不足而被排除在外（7，341，640）。归因于mtDNA基因组的读取数范围为5049至25，947（巴布亚假单胞菌为1647），覆盖率从16到82不等（表2）。我们从所有mtDNA区域恢复了完整的序列，除了D环的重复区域。

这些是首次报道的S. humboldti，S. magellanicus，S. mendiculus和P. papua的近乎完整的mtDNA基因组。没有D环的完整线粒体基因组在三个蝶形虫种中在15，514 bp和15，520 bp之间变化，在三个Pygoscelis物种中在15，490 bp和15，500 bp之间变化。

包括部分D环在内，三种蝶形树种的长度在16，367 bp值16，660 bp之间变化，三种蝶形物种的长度在16，653 bp值16，765 bp之间。这些mt基因组长度与P. antarcticus（15，972 bp），S. demersus（17，346 bp），E. mine. min（17，611 bp），E. chrysocome（16，930 bp）和P. adeliae（17，486 bp）的mtDNA基因组相当。

在属间比较中，不同基因的Ka/Ks比率的一般模式在成对物种之间相似（蝶形目，Pygoscelis，Eudyptula，Eudyptes，Aptenodytes;无花果。Ka/Ks比值均为<1（使用此方法，小于1的值表示负选择，大于1表示正选择）。

ATP8在所有属间物种比较中Ka/Ks比值和变异性最高值介于 0.1 和 0.4 之间。ATP8Pygoscelis和Spheniscus之间的Ka/Ks比值较低（0.09至0.15），A. forsteri和Spheniscus之间的Ka / Ks比率较低（0.14至0.16）。在小E.和大多数其他属之间观察到高ATP8 Ka/Ks比率（0.24至0.41）。

在这里，我们确定了选择中的mtDNA候选基因，这些基因可能参与企鹅对其环境的大规模适应。我们的结果表明，COX1具有很强的负性选择，而在ATP8和ND4上的密码子位点具有正选择。我们还发现ND4与海面温度之间存在高度相关性。

需要在种内水平上对这些基因进行进一步研究，以完全了解企鹅在不同环境条件下的适应性。这是一项新颖的研究，说明了大规模遥感作为理解分子水平上对环境的适应的有用方法的适用性。整合这些不同的数据可以深入了解企鹅的粪便如何适应其环境，从而如何应对未来人为引起的环境变化。

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