双孢蘑菇是典型的草腐性真菌。新疆农副产品原料丰富，闲置日光温室较多，使得双孢蘑菇产业已逐渐成为当地农业结构调整的支柱产业。目前，新疆主要利用种植蔬菜的日光温室进行改造后生产双孢蘑菇，菌包主要来自新疆九鼎天库生物科技有限公司及健源食用菌专业合作社等加工厂，栽培的品种有A15、W192、As2796等。但菌种供应主要来自内地，部分菌种仍由国外控制生产。菌种是双孢蘑菇产业链的首道关键环节，其质量好坏和成本高低直接决定了栽培成败。笔者在进行各类试验、示范及生产调研的基础上，较为系统地总结出我区双孢蘑菇的三级菌种生产关键技术，旨在为本地区菌种生产者提供技术参考。
经多次试验研究表明，双孢蘑菇目前最优母种培养基仍为麦粒煮汁培养基。其关键点是优良菌株的选择、组织分离部位的确定及培养基的制作。除从正规科研单位购买的母种外，凡经过分离培养获得的菌株用作母种时必须进行出菇试验，证明其具有优良性状，方可用于生产。
1.1 母种培养基制作 制作1 L麦粒煮汁培养基需麦粒 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 18～20 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g，蛋白胨1.5 g。操作要点是：将麦粒煮至透亮无白芯，表皮无破裂后，用4层纱布过滤。取滤液继续加热，并加入化学试剂、琼脂和蛋白胨，先要用少量凉水搅匀再加入，边加边用玻璃棒搅拌，试剂全部加入后定容。制作的关键环节是麦粒煮的火候一定要掌握到位，煮的过久麦粒表皮破裂，淀粉外泄，造成麦粒结块，灭菌不易彻底。此时，一些尚存活的抗热性细菌，遇到外泄淀粉营养便会造成木霉菌污染。过生，麦粒种淀粉、脂肪等物质不能分解为麦芽糖等物质，不易于菌丝利用，这是造成菌丝生长速度变慢的主要原因。
1 L麦粒煮汁培养基可分装试管80～90支，分装试管时要注意流出的培养基不可粘在试管口的壁上，以防日后生霉。然后用101kPa高压灭菌35 min，趁热摆成斜面培养基，长度为试管长度的2/3左右，斜面上端距棉塞2～3 cm为宜。做好的培养基放置2～3 d确认无菌后，方可使用。
1.2 优良菌株的获得
1.2.1 子实体选择 最好是选取前两潮菇形圆正、菌盖肥厚、健康、具有本品种特性的子实体，一般是随采随处理，在4℃保存最多不超过1 d，将其切除菇根，用无菌水将菇面冲洗干净，再用75%酒精棉对菇体表面进行消毒。
1.2.2 组织分离技术 在所选取的子实体的菇柄中部用解剖刀纵切一刀后，用手掰开菇体，再在菇盖与菇柄交界处切五个小方块，随后挑取一小块约0.5 cm大小的组织，迅速移接到试管培养基中间处并用棉塞封口。其关键技术，是如何判断出生命力较强的离体组织。
1.2.3 母种培养 接种后，将试管置于20～25℃下恒温遮光培养3～4 d后，可见到组织块上长出白色茸毛状菌丝体，周围无杂菌污染，即说明分离成功。然后在菌落的边缘，用无菌接种针挑取先端菌丝转移到新的培养基斜面上，在20～25℃下经过5～7 d培养，菌丝长满斜面而无杂菌污染的，即为纯菌丝体菌种，可用来进行扩繁。1支纯菌丝试管菌种一般可扩繁20～30支母种，1支母种可扩繁原种3瓶，扩繁时要先将老接种菌块去掉。
试验研究表明，双孢蘑菇原种麦粒培养基制作时，加入一些棉子壳、牛粪或粪草用作封口料，对菌丝生长能起引导作用，菌丝生长较均匀且较快。原种制作关键点是：要求所使用的封口料粪草须较碎、较短，以避免灭菌后麦粒与封口料出现断层，影响菌丝生长速度；其次麦粒要保持适宜含水量。
2.1 封口料制作 封口料用量约占麦粒培养基的10%～20%。用棉子壳、牛粪作原料，其比例按60%棉子壳、40%干牛粪、2%石膏、1.5%石灰，根据天气情况决定发酵时间的长短，夏季一般需7～10 d，发酵期间需翻堆2～3次。也可选用发酵好的粪草作为封口料，使用前用0.1%石灰水预湿，含水量应保持在45%，pH8左右。
2.2 培养基制作 制种前一天，先将麦粒淘洗干净，然后在0.2%石灰水中浸泡10～12 h，沥去水后用清水反复冲洗至pH8左右，然后煮沸至麦粒透亮无白芯表皮无破裂，约10 min后用笊篱沥干水分，摊开，至麦粒表面水分晾干，含水量在45%左右，加入1.5%轻质碳酸钙和1%石膏拌匀后装瓶。一般用750 mL的瓶装料，装至瓶肩后再用封口料进行封口压实，用抹布将菌种瓶内壁口擦干净，要求加棉花塞至距料面1 cm以上，松紧度以棉塞能提起整个瓶身为宜，并在棉塞上面盖上防水盖，避免棉塞潮湿而造成杂菌污染。之后在101kPa高压下灭菌3 h，待缓慢降压后出锅，搬至接种间进行臭氧灭菌。
2.3 接种与发菌 接种时，先用接种针将试管中老接种菌块去掉，然后迅速取出带培养基的母种放入原种瓶内的培养料上，立即盖好瓶口。
发菌场所要求干净整洁，空气清新，温度23～25℃，空气相对湿度60%～70%，遮光培养，摆放勿过挤，及时剔除污染瓶，培养25～30 d菌丝可布满瓶，待用。一般1瓶原种（750 mL）可接40袋栽培种。
栽培种培养基的配制，与原种培养基制作基本一致，只是不需加封口料，直接装袋（13 cm×23 cm聚丙烯袋），用套环封口，高压灭菌3 h，待自然降压后将料包运至冷却室，放至常温后才能进行接种。其关键技术是：在接种前须挑选健壮无杂菌污染的原种，并将封口料清除后方可挖种转接，要将菌种均匀覆盖于培养料表面，可促使菌丝快速布满料面，减少杂菌污染。
接种后在23～25℃下遮光培养，30 d菌丝可布满袋。每袋栽培种约350 g，一般1 m2料床需播3袋栽培种。
4.1 菌种质量鉴定 菌种质量鉴定，一般是通过感官检验和栽培性状检验来确定。感官检验，是从菌种的长势、颜色、菌龄、均匀度等方面确定菌种活力，这需要一定的经验值。栽培性状，可通过出菇试验，从菇形、出菇快慢、产量、品质等方面进行鉴定菌种种性。在菌种进行大量扩繁时，一定要对菌种的质量和种性做正规的栽培试验。
优良母种要求菌丝浓白、粗壮，无干燥、收缩和发黄现象；原种和栽培种要求菌丝色泽洁白无杂色（菌）出现，菌种瓶（袋）内无黄色汁液渗出，接种后一般48 h后开始萌发。
4.2 菌种保存 母种满管后短期保存，可置于4℃冰箱，保藏期不超过90 d；长期保存，可采用液氮保存法、石蜡保存法等。原种和栽培种一般不做储备菌种，根据栽培时间有计划进行生产。母种转管次数要少，最多不超过5次。原种和栽培种短时间保存，也可置于4℃冰箱保存，一般不超过30 d。一般栽培400 m2的设施内需栽培种420 kg，依次可推算需原种11瓶，母种4支试管。
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