文|胡叁叔
编辑|胡叁叔
前言地中海贫血症（简称β－地贫）是一种单基因遗传疾病，主要是由人类beta-beta珠蛋白变异所致，中国南部地区发病率最高。
突变可导致过渡性贫血，但该突变多发生在非编码区，导致非编码区变异对相应基因的转录调控作用鲜有报道。
通过CRISPR/Cas9对DNA序列进行定点修饰，实现DNA序列，这也是目前研究的热点。
我们从美国Addgene公司购买了CRISPR/Cas9质粒PX459，从上海碧云天公司购买了pCMV-GFP-p62。
采用德国徕卡设备制造的荧光反转显微镜，还有赛默飞世尔技术制造的PCR基因放大装置。
sgRNA目标序列为基础，合成2对互补引物，由于sgRNA都是正义链序列目标，所以需要在引物5'端添加BbsI酶的粘性末端，其中CACC在正向引物之前，AAAC在逆向引物之前（表1）。
sgRNA的磷酸化酶1μL，正向和逆向引物1μL，混合均匀后对5'末端的磷酸进行酸化，然后对其进行退火处理，得到一个双链体。
根据Trans5α感受态细胞的产品说明书，将10μL的连接产物转换到100μL感受态细胞中，然后轻轻地摇匀，在冰上放置30分钟。
在42℃的水浴中对45s进行热激，然后将其快速放到冰上进行2分钟的降温，再将其涂布在含50μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB固体平板上，37℃倒置培养16-18h。
测序证实：将8株菌株放入LB液相中，在37℃下，220r/min的摇床上进行12-16小时的扩增，对获得的PX459-sgRNA1-Cas9及PX459sgRnA2-Cas9双基因*蛋白进行序列分析。
筛选出PX45及PX45两个基因*蛋白，按照天根质粒微量萃取技术的要求进行筛选。
以该基因的左侧和右侧50个碱基的片段为其同源臂，制备了该基因的外源同源*模板ssODN（图1）。
为了便于进一步的鉴别，我们还提出了一种新的限制内切酶AatII的特异性结合位点。从图1可以看出，ssODN1是正的序列，ssODN2是逆的序列。
在细胞传代2-3次，在表现出良好的特性和状况之后，将细胞进行消化，放入到一个六孔盘中。
本项目拟以HEK293T细胞为研究对象，采用不同的方法构建含有GFP的pCMV-GFP-p62基因的脂质体，通过检测其在HEK293T细胞中的表达量，筛选出适宜的质粒。
采用X-tremeGENEHP、PX459-sgRNA1-Cas9/PX459-sgRNA2-Cas9、ssODN1/ssODN2，在15-25℃条件下进行瞬时涡流混合。
然后将含PX459-sgRNA1-Cas9的1.5倍的PX459，2-3个双基因敲除后，分别在室温和室15~20分钟，以获得转染复合体。
在24小时之后，将所有的转染复合物都放进去，然后将其替换成2mL包含0.6μg/mL的嘌呤霉素的无血清培养基来进行药物的筛选。
持续培养48小时，采集孔洞中的半数细胞，并抽取其基因组DNA，通过PCR扩增出包含变异的序列，对其进行测序，从而获得对sgRNA1和sgRNA2靶基因的阳性克隆。
本项目拟从以下4个方面进行研究：①sgRNA1 ssODN1；②sgRNA1 ssODN2；③sgRNA2 ssODN1；④sgRNA2 ssODN2。
按照1、2、3中所述的步骤，分别对每组进行48小时的脂质体转染制取HEK293T细胞，采集野生型293T细胞及试验组①~④的一部分细胞，抽取其基因组DNA，PCR扩增含有目标基因的片段。
最终，将200ngPCR产物，分别用于T7EI和AatII的酶切，在利用10×Loadingbuffer结束酶切反应之后。
应用ImageJ对其进行图像处理，，以T7EI酶切活力和AatII酶切活力，分别代表剪切和融合效率。
整合细胞占T7EI切割阳性细胞的百分比为依据，设置相对整合效率的计算公式：(AatII酶切活性/T7EI酶切活性）×100%。AatII对其进行剪切，表明有更多的细胞进行了*和融合，且融合的效果更好。
以酶实际验的结果为依据，选取整合效率最高的试验组，使用96孔板计数稀释接种的方法进行单克隆筛选。
将细胞使用包含10%的FBS、1%双抗的DMEM培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养4-5天后，对其进行观察去除双细胞孔，并对其形态正常且单个细胞孔进行标记。
在连续7-9天的条件下，将2/3的菌群全部抽走，抽取菌群中的10个菌群，利用sequencing1.2.4中的PCR技术，对菌群中的所有菌群进行扩增和测序，筛选出具有该菌群。
通过荧光显微镜下的观测，在1ug的质粒中，GFP的含量不足20%，在2ug的质粒中，GFP的含量高达80%，在3ug的质粒中，GFP的含量超过85%（图3）。
在此基础上，本研究拟采用2µg的基因转染技术，以降低基因转染过程中的毒副作用，并获得良好的转染效果。
sgRNA切割效率试验（T7EI酶切活性）：PCR扩增包括了突变位点的序列，实验组①-④的PCR产物的总长度为578bp，并且都显示出了剪切活性。
经酶切后分成了3个条带：原来的条带578bp，被剪切后的两个条带372bp和206bp（图4）。
通过灰色关联分析，试验1~4的剪切率为27.19%，试验2~4的剪切率为18.62%，试验3~4的剪切率为21.49%（表2）。
ssODNs整合效率实验（AatII酶切活性）：在ssODNs整合到目标位置的时候，它会被AatII酶识别并分解。
从图4的电泳图及表2的灰度分析结果可以看出，实验组①-④都有AatII酶的酶切活性，整合效率为26.41%、22.25%、14.78%、12.84%。
从表2中总结出的各组切割效率、整合效率和相对整合效率可以看出，实验组①的切割效率和整合效率最高，其相对整合效率为97.14%，与相对整合效率最高的试验组②（97.96%）没有明显差别。
试验中①与②的高峰数据较③与④的高峰数据更多（见图5)，表明试验中①与②的裂解与集成率更高，由于没有经过单克隆筛选，呈现为杂合峰形。
CRISPR/Cas9是近年来发展起来的一种全新基因编辑技术。CRISPR/Cas9是一种基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术。
CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过导向sgRNA招募Cas9蛋白，在细胞内靶基因特定位点进行特异切割，形成DNA双链断裂。
这种方法具有操作简单、重复使用、插入效率高等优点，已被用于医药和生命科学等诸多领域。
HDR基因的高效表达，对于疾病模型的构建、基因治疗以及基因工程育种等，都有着非常重要的意义。
增加HDR的使用频次，对于提升编辑的效果非常关键。利用单分子给体DNA作为分子模板，可以有效增加HDR的频谱。
相对于传统的dsDNA小片段插入、缺失或点突变等方式，以单链ODN为供体更高效。
此外，双链ODN的同源模板受拓扑结构和同源臂长短等因素影响，其制备周期较长，而单链ODN的制备周期较短，而且无需添加任何筛查标签，能够一次实现基因精准的修补，具有较高的安全性和准确性。
Kwart等采用CRISPR/Cas9技术及ssODN基因敲除hiPSCs后，可使hiPSCs中95%以上的基因发生二次编辑，导致indel缺失。
本项目拟采用CORRECT技术，对多个位点进行二次编辑，实现对单一或双等位基因高效率、高精度的选择性插入。
从而将HDR的二次编辑精度提升至各等位基因的10倍以上，并在更靠近PAM的区域，实现更高的HDR效率。
为此，我们拟采用新型CORRECT基因编辑技术，将CRISPR/Cas9中的同义碱基嵌入到目标PAM的相邻区域，抑制了异常的二次编辑。
此外，我们还将AatII的特异性结合位点引入PAM头5个碱基，从而提高了PAM的基因编辑与整合能力。
我们前期研究表明：sgRNA1与sgRNA2都是正向与反向的结合位点，而正向与反向的ssODN结合位点仅占26.41%与22.25%。
正向与反向的ssODN结合位点仅占97.14%与97.96%，说明正向与反向的ssODN并没有显著作用。
在sgRNA2基因编码中，正向与反向ssODN1基因编码基因的转录水平（14.78%）、12.84%（12.84%）、79.42%(59.72%)，提示正向ssODDN1基因的转录水平（pre-ssODdn1）比sgRNA编码基因编码水平高。
虽然已有研究表明，同义突变并不会改变单一碱基的结构，但其在DNA和RNA层面上对转录调节和自身生理活动有何影响，目前还不明确。
自从基因编码被发现后，一直被普遍地假设基因编码是一个简单的、没有任何危害的、不会引起基因编码的同义变异。
但是，Shen等人在构建了21个典型基因8341个突变子后，却发现75%以上的突变子严重影响了其适合度，其影响程度大于0.1%。
然而，这一试验仅限于单倍体酵母，后续还有待于对多种有机体和混杂情况下的试验加以证实。
尽管没有对点变异进行过细胞生物学的实验，但在方法学方面，我们提出了一种可用于某些特殊变异的高效变异编辑技术，为以后的工作打下了坚实的理论和技术基础。
参考文献：
张楷，刘蔚，刘小凤，等《利用CRISPR／Cas９系统构建人HPRT１基因定点突变细胞株》
高利利，王聪聪，杨帆，等《CRISPR／Cas９介导的RPSA基因敲除细胞系的建立及其应用》
