文/农人麦客张
编辑/农人麦客张
传统的多肽来源于带注释的基因区域，它们通常由5-75个氨基酸组成，在植物发育和抗逆性中起作用。
作为信号分子，传统的多肽介导植物细胞间的短距离通讯。
根据其n端信号肽可分为分泌型和非分泌型，传统多肽通常经过翻译后修饰。
大多数已发表的传统的多肽，包括系统素、胚胎周围区域相关、末端肽、植物磺酸、快速碱化因子、早期结瘤蛋白、根生长因子/胚胎周围区域相关样，功能与激素相似。
在高通量测序出现之前，大多数传统的多肽是通过反向遗传筛查发现的。
与传统多肽相比，非常规肽的来源范围更广，包括基因间/内含子区、长链非编码。
近年来，许多非常规肽通过高通量测序被发现，并被证明参与植物的生长发育，在拟南芥中，非常规肽分别调控根系生长、叶片形状和氧化胁迫耐受性。
最近在玉米和葡萄等作物中发现了非常规肽，非常规肽对多种真菌具有广谱的抗真菌活性。
这些发现表明非常规肽具有改善作物农艺性状的潜力。
鉴于新型冠状病毒的功能，新型冠状病毒的鉴定方法日益受到重视。
在这篇综述中，我们首先考虑了用于准确鉴定植物非常规肽的方法:核糖核酸序列和肽基因组学。
接下来，我们将介绍由微RNA或上游开放阅读框架编码的非常规肽，这些非常规肽已经被实验证实可以影响植物的特性。
最后，我们考虑了如何通过基因编辑技术Cas9编辑非常规肽序列，或通过在群体水平上选择非常规肽中罕见的等位基因变异来改善作物性状。
2.1.核糖核酸序列和肽基因组学:在全基因组水平鉴定非常规肽的两种方法
目前，新型冠状病毒鉴定主要有两种技术:核糖体分析和低分子质谱肽基因组学。
2.2. 核糖核酸序列:识别植物“暗”基因组区域非常规肽的有用工具
虽然传统多肽和非常规肽是由小的开放阅读框架产生的，但大多数传统多肽是由大的前体产生的。
相比之下，由于大多数非常规肽起源于非编码区，它们经常在基因组注释过程中被过滤掉。
广义的翻译组包括翻译过程中涉及的所有元件:信使RNA、核糖体、转运RNA、一些调控RNA、新生肽和各种翻译因子。
因为翻译组通常是指直接与核糖体结合的RNA，它是转录组和蛋白质组之间的桥梁。
由于核糖体的沉降系数高于其他细胞器，多体谱分析使用蔗糖密度梯度离心分离核糖体复合物。
在梯度离心过程中，与RNA分子结合的核糖体的数量决定了其沉降速率，导致不同核糖体数量的RNA分离。
然而，这种方法回收的核糖体- RNA复合物的总量极低，难以获得足够的RNA进行高通量测序。
核糖体新生链复合体测序中的核糖体使用单浓度蔗糖缓冲液分离，该方法受核糖体复合物完整性的限制，不能用于确定核糖体的位置分布。
目前，核糖体分析是使用最广泛的方法，因为它提供了最高的通量，并允许核糖体密度可视化，使研究人员能够识别未注释的基因组区域的非常规肽。
近年来，核糖体分析被广泛应用于植物的生物和非生物胁迫研究，尽管大量的核糖体分析数据已经证实了核糖体足迹的存在，但由于目前的质谱灵敏度水平不足，尚不清楚开放阅读框架编码的肽在体内是否稳定。
尽管如此，核糖体分析代表了一种研究翻译调控和鉴定非常规肽的新方法，将在未来的小肽研究中得到广泛应用。
2.3. 肽基因组学:一种将质谱法和基因组学相结合的植物非常规肽鉴定方法
肽组学是研究内源性肽的一门新兴技术，可用于分析和鉴定体内肽，肽组学衍生自蛋白质组学，使用类似的仪器，但有不同的目的。
肽组学与蛋白质组学的最大区别在于，肽组学避免了蛋白酶的预处理消化，从而使研究人员能够识别天然内源性非常规肽。
然而，肽基因组学的检测效率依赖于质谱仪，并且无法检测到低丰度的内源性肽。如果样品在制备阶段被降解，大量的肽片段将对准前体蛋白的降解产物，肽稳定性是肽基因组学中最关键的问题。
定制肽数据库通常通过基因组六帧翻译或转录组三帧/六帧翻译获得，但这种构建策略导致数据库非常大。
利用计算方法去除冗余序列是构建定制数据库的最大难点。去除冗余序列有几种策略，包括根据与已知编码序列的相似性选择短的开放阅读帧，使用编码势预测工具，以及排除短于某个最小长度的序列。
核糖核酸序列和肽基因组学的结合使用将有助于非常规肽的挖掘。
3.1.微RNA衍生肽:一类衍生的非常规肽，可以改善植物性状
微RNA是一种短的RNA，通过切割靶基因的信使RNA序列或抑制其翻译，在转录后水平上控制靶基因的表达。
一种微RNA衍生肽的小肽通过改变苯丙素生物合成途径相关基因的表达来调节类黄酮含量，并通过生长素信号通路增加根伸长。
最近的一项研究表明，植物硫代激素基因与微RNA衍生肽相互作用，并通过生长素生物合成参与调节根长。
这是两种不同类型的小肽共同调节同一植物表型的第一个实验证据，与以往报道植物磺胺酮影响植物生长发育不同，这种调控关系依赖于微RNA衍生肽。
3.2. 微RNA衍生肽调控靶基因的潜在机制
外源应用合成微RNA衍生肽引起的植物表型变化可用于微RNA衍生的微RNA衍生肽的功能分析。
将荧光素标记的微RNA衍生肽应用于拟南芥根部，评估微RNA衍生肽在拟南芥中的吸收率。
但仅在根冠和分生组织中检测到荧光信号，韧皮部和叶片中未检测到荧光信号。
这一发现表明，微RNA衍生肽通过被动扩散进入根系，而微RNA衍生肽是影响根系生长的局部信号。
微RNA衍生肽可以通过韧皮部快速从根转移到芽，并表明微RNA衍生肽的不同吸收特性可能取决于肽一级结构。
电泳迁移率转移试验证实，微RNA衍生肽可以与特定的DNA片段相互作用，但启动子基序有待发现。
3.3. 功能性微RNA衍生肽的应用与展望
虽然只有少数微RNA衍生肽被开发为农学中的有用工具，但对微RNA衍生肽的研究正在增加。
微RNA衍生肽似乎对它们的靶基因具有特异性，这表明它们具有精确改善植物农艺性状的潜力。
在许多物种中，深层根系对有效的养分吸收很重要，根的生长可以通过特定的微RNA衍生肽调控。
3.4.上游开放阅读框架衍生的非常规肽:另一类主要的非常规肽源自控制主要ORF编码能力的50个未翻译区
上游开放阅读框架起源于非编码区，是一类重要的非常规肽，目前，对植物非常规肽的研究大多集中在上游开放阅读框架上。
在拟南芥中，37%的基因至少有一个上游开放阅读框架，据报道，在玉米、水稻和大豆中也有类似比例的上游开放阅读框架s基因。
因此，上游开放阅读框架和主开放阅读框之间的翻译调控关系在植物基因组中普遍存在。
3.5. 上游开放阅读框架影响主开放阅读框翻译的机制
信使RNA翻译是一个复杂的过程，包括起始、延伸和终止，其中起始步骤是关键步骤。
如果将一个上游开放阅读框架插入到不合适的序列中，核糖体复合物可以通过“泄漏扫描”恢复主开放阅读框的翻译。
另外，当核糖体停滞或与RNA分子分离引发无义介导的衰变时，主开放阅读框翻译效率会降低。
3.6. 上游开放阅读框架s在植物适应生物和非生物胁迫中的作用
通过传统育种将赋予理想农艺性状的基因整合到新的作物品种中，需要大量的劳动和物质资源。
由于上游开放阅读框架在植物基因组中普遍存在，因此编辑上游开放阅读框架以提高主开放阅读框蛋白水平可能会得到广泛应用。
因此，迫切需要一种高通量的实验流程来鉴定体内非常规肽的功能性上游开放阅读框架。
通过对生长素反应因子的翻译调控，生长素反应因子中的上游开放阅读框架s负责在核糖体突变体中观察到的表型。
病原菌攻击是植物面临的最严重的生物胁迫,为了提高作物的抗病能力，育种者通常通过杂交将不同类型的抗病基因聚集在一起。
因此，通过对上游开放阅读框架的操纵，植物的性状可能得到改善。
3.7. 使用基因编辑工具操作上游开放阅读框架的高通量工作流程及其应用
基于上游开放阅读框架介导主开放阅读框翻译的特性，人们开发了一种方便而精确的调控基因表达的策略。
基因编辑工作流程包括以下步骤:
1.识别与重要作物性状相关的候选基因;
2..利用生物信息学工具预测或利用核糖体分析鉴定含有AUG和非AUG起始密码子的上游开放阅读框架;
3.构建一系列突变的上游开放阅读框架双荧光素酶报告载体;
4.利用植物原生质体中的瞬时报告基因测定来确定哪些上游开放阅读框架具有功能;
5.构建上游开放阅读框架位点特异性引导RNA载体，通过遗传转化对上游开放阅读框架序列进行编辑;
6.利用PCR技术收获和筛选不含cas9的同源突变体;
7.确定经上游开放阅读框架编辑的转基因植物的表型。
3.8.结束语和未来展望
与传统多肽相反，非常规肽主要起源于未注释的区域，这使得它们的识别变得困难。
幸运的是，随着核糖体分析和肽基因组学等高通量测序技术的发展，在全基因组水平上鉴定非常规肽已经成为可能。
这两种方法各有优缺点，核糖体分析可以准确定位未注释区域的核糖体扫描足迹，但不能表明开放阅读框架编码的肽在体内是否稳定。
虽然肽基因组学不如核糖体分析准确，但它保证了非常规肽的真实性，由于这些原因，将这两种方法结合起来将是确定非传染性疾病的最常用方法。
然而，它只应用于少数植物物种，随着核糖核酸序列分析算法的发展和肽基因组学敏感性的提高，非常规肽可能会在其他植物物种中被鉴定出来。
研究人员可以使用核糖核酸测序或肽基因组学来寻找具有有用农艺效应的微RNA衍生肽。
上游开放阅读框架的自然变异拓宽了种群水平研究的视野，非常规肽可能是未来数量性状位点和驯化选择研究的另一个领域。
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