今天推送的文章发表在Nature Communications上的“Natural diversity screening, assay development, and characterization of nylon-6 enzymatic depolymerization”，作者为美国国家可再生能源实验室的Gregg T. Beckham。
聚酰胺 (PA)，通常称为尼龙，是一种多用途、酰胺键联的石油衍生热塑性塑料。最普遍的尼龙是 PA6 和 PA6,6，其生产属于能源密集型和温室气体 (GHG) 排放密集型，仅美国尼龙消费就消耗了 197 兆焦/千克的能源，并排放了 10.4 kg-CO2e/kg的温室气体。然而，目前收集的消费后尼龙废料很少，而且回收具有挑战性，需要更广泛的尼龙回收方法来管理这种聚合物在使用寿命结束时的情况，并采用选择性技术释放对闭环回收特别感兴趣的 PA 单体。作者检测了 40 种建议的尼龙酶的 PA6 解聚潜力（图 1B），选择具有一系列酶活性位点结构和各种先前描述的底物偏好的尼龙酶。使用基于LC-MS/MS 的高通量尼龙解聚分析方法测试了这些酶水解 PA6 薄膜的能力。本研究强调了未来需要改进的领域，以创建可行的 PA6 生物催化回收策略。
潜在尼龙酶的鉴定、表达和酰胺键水解测定
首先构建了一组不同的酶，最初重点关注同行评审文献和专利中报道的具有 PA 聚合物或线性低聚物解构活性的生物催化剂（图 1B）。纳入了一些已知的聚氨酯酶和氨基甲酸酯酶，假设这些酶也可能对 PA表现出活性。根据 NylCp2 和 NfPolyA 同源物搜索，从潜在耐热来源中选择酶，选择了其他 Ntn 水解酶和 AS 家族酶候选。具有经典 Ser-His-Asp (SHD) 催化三联体的丝氨酸水解酶（包括角质酶）和使用丝氨酸或胱氨酸催化亲核试剂的蛋白酶也被添加到该组中。同时添加了其他几种具有 PET 活性的SHD 水解酶，包括一些先前设计的热稳定突变体。经过选择，根据酶的催化活性和之前描述的底物偏好，酶被大致分为六类（图 1B）。分组如下：(1) NylC 型酶、Ntn 水解酶，可水解 PA6 三聚体和更长的 PA 寡聚体，(2) NylB 型酶、先前证明的丝氨酸水解酶（Ser-Tyr-Lys 催化三联体）特异性水解 PA 二聚体，(3) 酰胺酶、作用于线性酰胺或含有氨基甲酸酯键的化合物的 AS 家族酶，(4) Ser-His-Asp水解酶(SHD-水解酶)，对酯连接聚合物有底物偏好的丝氨酸水解酶，(5) 蛋白酶、丝氨酸和胱氨酸蛋白酶，可裂解蛋白质中的肽键，以及 (6) 杂项 (misc.)，不属于其他五种主要类别之一的酶。
对来自农杆菌（NylCA) 和 Kocuria (NylCK)的 NylC 进行了合理突变提高其熔化温度 (Tms)。在这两种酶中，先前描述为潜在不稳定的残基被替换为 NylCp2中的同源对应物（S111G 和 A137L），同时 E263Q 还被引入 NylCA作为 NylCK的潜在稳定突变。这些突变使 NylCK-TS 和 NylCA-TS 的蛋白质 Tm分别提高了 16.4 °C 和 25.1 °C。作为 NylB'的三点突变体（NylB'-SCY：R187S/F264C/D370Y）被证明具有增强的 PA6 二聚体水解活性，将相应的突变引入 NylB，生成 NylB-SCY。由此产生的 WT 和工程酶组由 41 种候选酶组成。五种酶是从商业来源购买的；在 36 种商业上无法获得的酶中，有 35 种是从大肠杆菌中成功表达和纯化的，从而得到了一个包含 40种酶的候选池。为了测试每种酶水解酰胺键的能力，将候选酶与 N-(4-硝基苯基)丁酰胺 (N4NB) 一起孵育（图 2）。 N4NB 中酰胺键的成功水解裂解导致对硝基苯胺 (p-NA) 的释放。酰胺酶和NylB型酶表现出最高水平的酰胺水解活性，UMG-SP酶（宏基因组酰胺酶），NfPolyA64 （来自 N.farcinica 的聚酰胺酶）、GatA69（来源不明的酰胺酶）和 MsmegA（宏基因组酰胺酶）在五分钟内完全转化 500 µM N4NB。
LC-MS/MS高通量固体PA6解聚分析方法的建立
由于预测产物中缺乏强发色团，并且需要低于百万分之一 (ppm) 的检测限，开发了一种LC-MS/MS分析方法监测 PA6 解聚反应后主要预测的可溶性释放化合物。使用这种异位分析方法，在三分钟内即可检测到从单体到五聚体的 6-氨基己酸 (6-AHA) 线性低聚物以及从 ε-己内酰胺到三聚体的环状低聚物（图3A）。所有分析物均可在 0.01–7.0 µg/mL 范围内检测到，高于定量上限的样品进一步稀释，以便能够在校准范围内进行定量。校准曲线在分析每组样品之前运行，以解释质谱信号漂移（图 3B）。
评估固体 PA6 底物上潜在的尼龙酶
对于活性筛选，使用来自 Goodfellow 的市售 PA6 薄膜作为底物。比较酶组的反应在 40 至 70 °C 的温度下进行了 10 天，时间点分别为 24、72、168 和 240 小时。不含酶的对照测定导致线性 6-AHA 寡聚物的释放最小化，当不存在酶时，6-AHA 单体在所有测试温度下均低于检测限（补充图 5A）。酶反应在 100 mM 磷酸钠缓冲液 (NaPi)、pH 7.5、150 mM NaCl 中进行，含有 2 μM 酶和 13 mg PA6（两个 0.5 × 0.5 cm PA6 薄膜的正方形）。在所有测试的酶中，ε己内酰胺的释放程度是一致的；对于大多数检测的酶，6-AHA 环状二聚体和环状三聚体的浓度在反应过程中也保持恒定（补充图 5B）。这些结果表明反应中观察到的低聚物水平的变化主要归因于酶的作用。
在不同测试组的一系列酶中观察到尼龙酶活性：总体而言，31 种酶表现出可测量的活性，而 9 种酶表现出高于背景水平的最小可检测的额外可溶性产物释放（图 4）。不同酶组释放的产品似乎有不同的分布。即，NylB 型酶、GatA 和 UMGSP-1 主要产生 6-AHA 单体，而大多数酰胺酶和角质酶释放线性产物的混合物，许多酰胺酶只产生很少的 6-AHA 五聚体。然而，最活跃的 NylC 型酶反应以 6-AHA 二聚体为主。由于在 NylCK-TS 存在的反应条件下 24 小时后 6-AHA 二聚体保持完整。正如假设的那样，热稳定突变似乎是有益的，与野生型 (WT) 对应物的最佳温度 50-60 °C 相比，所有 NylC-TS 突变体在 70 °C 下都表现出更高的活性（图 4）。比较两种酶在导致最高产物释放的温度（50 °C 和 80 °C），NylCK-TS 从反应 3 小时起开始产生更多的 6-AHA 当量，在 10 天的过程中释放多出 28.8% 的 6-AHA 当量（图 5B）。
尽管 NylB 对 PA6 膜解构的活性不大，但 NylB’（一种具有 88% 序列同一性的 NylB 同源物）在 40 °C 下 10 天内释放了 72.9 µM 6-AHA 当量（图 4B）。三点 NylB' 突变体 NylB'-SCY 活性更高，热稳定性更高，在 50 °C 时具有最佳 6-AHA 等效释放（130.2 µM 6-AHA 等效），相当于 0.26 wt% PA6 解构后反应 10 天。对于尼龙活性 SHD 水解酶，Fusarium solani 角质酶 (FsC) 和 Thermobifida cellulosilytica 角质酶 1 (ThcCut1)释放的可溶性低聚物混合物表明表面残基的非特异性裂解，而不是协调的、渐进的解聚活性。这种作用模式的支持来自于测试的最活跃的 SHD 水解酶 LCC-ICCG（图 4B），它在 70 °C 下 10 天的过程中仅产生 49.8 µM 的 6-AHA 当量，相当于 0.09 wt PA6 薄膜的解聚百分比。同样，酰胺酶也观察到低程度的解聚，可能是由于其耐热性低，大多数在 40 °C 以上就会失活（图 4A）。在酰胺酶中，GatA 和 UMG-SP-2 产生最多的 6-AHA 当量（图 4B），相当于 0.2–0.25% PA6 薄膜解聚。与 SHD 水解酶一样，所有酰胺酶的低解聚率目前再次表明表面改性过程而不是显着的本体 PA6 解聚。
性能最佳酶的深入表征
检测了表现最好的酶的一个子集，包括 NylCK-TS、Tt-NylC 和 NylB’-SCY，以测试是否可以提高 PA6 解聚的速率和程度以及了解其作用模式。NylB’-SCY 反应在其最高操作温度 50 °C 下进行，而 NylC 型酶反应在 60 °C 下进行，以便在同系物之间进行公平比较。对于所有三种酶，将底物负载量从 0.32-1.6 wt% 增加（一到五个方格的 PA6 膜）可提高产品释放量，很可能是由于可用反应表面积的增加（图 6A）。 NylCK-TS 和 NylB'-SCY 在所有底物负载量下的产物分布保持恒定，而 6-AHA 三聚体在 Tt-NylC 解聚反应中积累。增加酶负载对总 PA6 膜解聚几乎没有影响（图 6B）。在任何条件下，6-AHA 等效释放从未超过 300 µM，反应中总 NylCK-TS 解聚的改善停滞在 0.1 µM 酶以上（8 µM 酶/g PA6）。有趣的是，在 NylCK-TS 酶负载量较低时，反应速率会减慢，观察到 6-AHA 三聚体与五聚体产物的比例较高。
NylCK-TS 反应曲线的检查
使用最活跃的酶 NylCK-TS进行测定，确定是什么限制了 PA6 的酶解聚并导致观察到的渐近反应曲线。有趣的是，在反应中加入牛血清白蛋白 (BSA) 可以实现相同水平的 PA6 解聚，而酶负载量减少 100 倍（图 7A）。由于已知 BSA 可以防止反应中的非特异性结合，因此这些发现表明 NylCK-TS 的活性可能会受到非生产性 PA6 结合事件的显着影响。或者，BSA 可以涂覆反应容器，减少酶对这些表面的吸附，从而促进 NylCK-TS 向聚合物表面的传质。在酶反应三天或七天后，通过补充新鲜的 NylCK-TS 并未恢复反应进度（图 7B）。然而，在已运行三天（反应平台开始）的 NylCK-TS解聚反应中添加新的 PA6 底物（13 毫克），导致额外的产物释放量与原始底物的释放量相似，其中在 7 天的反应中添加底物后观察到相同的关系（图 7B）。添加新底物后的反应曲线与标准反应中看到的 6-AHA 等效释放相匹配，如图 5 和 6 所示，表明 NylCK-TS 在 60 °C 反应三天和七天后几乎保留了全部活性，并且不存在可以解释反应停滞的抑制化合物。
总而言之，这些结果表明 NylCK-TS 的反应平台是由于反应 10 天后该酶缺乏剩余可水解底物的结果。此外，通常对于更广泛的酶促塑料解聚，解构的速率和程度对底物结晶度高度敏感。然而，对于用 NylCK-TS 进行 PA6 解聚，使用结晶度更高的 PA6 薄膜基材，与更加无定形的 Goodfellow 薄膜的反应相比，导致释放出相当数量的 6-AHA 当量（DSC 测得结晶度为 13.2%，图 7C）。因此，NylCK-TS 可能仅对薄膜表面上的少量可接近的尼龙聚合物起作用，因此未达到底物结晶度在反应进程中发挥作用的解聚程度。PA6 与 NylCK-TS一起孵育的 SEM 图像揭示了轻微的表面粗糙化，但没有通常与更广泛的生物催化聚合物解构相关的明显凹坑或特征（图7D）。
DOI：10.1038/s41467-024-45523-5
文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-45523-5
