微生物通过多种机制不断地调整它们的蛋白质以适应不断变化的环境，这些机制从较慢的转录调节到通过与其他蛋白质或小分子的相互作用来快速调节蛋白质活性。共价翻译后修饰(PTM)可以实现长期活性调节，即使在最初的刺激过去后也能持续。由数百种激酶和磷酸酶催化，可逆丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸(S/T/Y)磷酸化是最常见的PTM之一，但人们一直认为在细菌中不太普遍。因为发现磷酸化的蛋白质较少，并且大多数蛋白质被修饰程度较低。
为了更广泛地评估细菌中S/T/Y磷酸位点的功能，作者在此关注大肠杆菌的中心代谢，通过系统地表征大肠杆菌代谢中S/T/Y磷酸化的功能相关性，作者发现52个突变的磷酸化位点中有44个基于生长表型和细胞内代谢组谱具有功能性。通过有效地将已知功能性磷酸化位点的数量增加一倍，作者提供了证据表明蛋白质磷酸化是细菌代谢的主要调节过程。结合体外和体内实验，作者证明了单个磷酸位点如何通过包括屏蔽底物结合位点、限制结构动力学，并破坏与体内活动相关的相互作用，该成果发表在《Nature Communications》。
大多数磷酸位点突变会影响细胞生长
为了系统地探索大肠杆菌中磷酸化的功能相关性，作者重点研究了六项可用的磷酸化蛋白质组学研究中至少有两项报告的磷酸化位点。具体而言，作者选择了位于23种酶（包括转移酶、异构酶、氧化还原酶和裂合酶）上的52个单磷酸位点或靠近的多个磷酸位点（图1a）。只有四种酶位于核苷酸、脂质和氨基酸代谢以及氧化应激途径的中心代谢之外。为了消除磷酸化，通过将S和T突变为丙氨酸(A)，将Y突变为苯丙氨酸(F)来去除可磷酸化的羟基。为了模拟磷酸化，通过用谷氨酸(E)取代S和T来模拟磷酸化的负电荷。由于缺乏合适的天然氨基酸，无法模拟Y的磷酸化。作者将点突变和缺失突变体进行比较，总体而言，52个磷酸位点中30个的突变影响了至少一种条件下的生长速率（图1b、c）。平均而言，磷酸化位点突变体的生长缺陷不如缺失菌株明显。拟磷和消除突变中生长效应的相似分布表明磷酸化可以同时具有激活和抑制作用（图1b）。在中枢代谢之外，作者观察到脂质合成(KdsD)和氧化应激途径(AhpC)中磷酸突变体的轻度生长缺陷，并且没有Adk和MetK磷酸突变体的表型，尽管MetK磷酸化突变体在竞争筛选中在葡萄糖上是首选。磷酸化突变体与各自缺失菌株的比较表明磷酸化激活ManX和Gnd，抑制PykA和TpiA，并对GpmA、PykF、SucB和AceF具有位点依赖性影响。Icd、AcnB和Pta中的亚磷酸酯突变导致特定条件下的致死率，因为在这些情况下催化残基发生了突变。总体而言，代谢磷酸化突变体中的大部分生长缺陷表明磷酸化调节在协调中枢代谢中的重要作用，但迄今为止未被充分认识。
图1. 磷酸化位点突变的定位及其对细胞生长的影响
代谢组学揭示了没有细胞生长表型的磷位点功能
虽然改变的生长表型强烈表明大多数研究的磷位点具有功能性，但生长表型的缺失并不排除响应酶活性改变的代谢补偿的可能性。为了评估突变的功能后果，作者通过FIATOF-MS质谱确定了所有突变体的细胞内代谢组。磷酸位点突变的代谢结果为拟磷或消除突变体表现出的功能提供了证据：（i）局部代谢重排，以及（ii）在任何测试的生长条件下与相应基因敲除的代谢谱的相关性（图2a）。磷酸化突变体和敲除之间的局部代谢变化和一致的代谢特征提供了38个磷酸位点功能性的证据，其中14个在表型上是沉默的（图2b）。通过比较消除或模拟磷酸化的表型和代谢结果，以及在可用的酶缺失情况下，作者认为对大多数研究位点而言，磷酸化对酶活性产生正面或负面影响（图2b）。只有13个磷位点没有表现出代谢表型，其中8个也没有生长表型。总体而言，综合代谢和表型证据表明85%的研究磷位点具有功能性。
图2. 磷酸化位点功能的代谢证据
磷位点突变的体外表征
为了验证功能，作者接下来在体外表征了磷酸化位点突变体的酶的特性，包括AcnBT242/S244/S245、PtaS691、SucBS115、GpmAS14、Y92、T122/T127、PykFS198、TpiAS177和T179，这些点突变导致细胞生长速率比野生型至少降低了25%。这些磷酸位点突变被引入到带有His标签的ASKA文库质粒上编码的七个基因中。为了排除蛋白质错误折叠导致突变表型的可能，作者使用从大肠杆菌过表达菌株中纯化的野生型和磷酸化突变酶进行了热变换测定。Gnd、PykF、TpiA、Pta和SucB的磷突变体在熔化温度(Tm)方面没有或低于1°C的变化，表明折叠没有显着变化（图3a）。对于GpmA和AcnB，作者观察到Tm显着降低，这表明所研究残基的任何突变都会影响蛋白质折叠和稳定性。虽然这并不排除这些磷酸位点的功能，但观察到的GpmAS14、Y92、T122/T127和AcnBT242/S244/S245磷酸化突变体的生长表型和代谢变化可能是由错误折叠的蛋白质引起的。为了评估磷酸位点突变的生理后果是否确实是由改变的酶活性引起的，作者确定了TpiA、Pta、Gnd和PykF磷酸突变体的体外活性（图3c和补充数据7）。TpiAS177E的拟磷突变导致酶几乎没有活性，而TpiAT179E具有较温和的影响。生理和代谢数据表明，GndS304和PykFS198的磷酸化激活酶活性（图2b），但这些突变体的体外活性与其野生型对应物无法区分（图3c）。
磷酸化直接抑制Pta和TpiA，而在体内间接影响Gnd和PykF的活性
在葡萄糖生长期间，通过拟磷突变抑制TpiA增加了甲基乙二醛途径中间体(R)-S-乳酰谷胱甘肽的浓度（图3d）。S177的磷酸化直接抑制TpiA活性，通过T179处的拟磷突变进行抑制具有类似的效果，但由于在体外酶活性受到的抑制要低得多（图3c），因此在体内突变产生的影响也较温和（图3d）。拟磷Pta S691E在体内确实是无活性的，只有野生型可以挽救S691A的致死表型，而拟磷Pta酶则不能。总的来说，作者的结果表明醋酸盐的分泌可以通过抑制性磷酸化来调节。
对于Gnd和PykF，磷酸化突变体的生长速率都降低了（图1c），但纯化的突变体酶的体外活性没有改变（图3c）。由于突变体的解链温度实际上没有变化（图3a），错误折叠可能不是观察到的生长缺陷的原因。此外，作者发现过表达的野生型和突变型酶之间的PTM没有差异，表明没有补偿性修饰。
图3. 磷酸化位点的干扰的实质性影响
总结
本研究中，作者通过分析在23个中心酶的52个磷酸化位点模拟或消除磷酸化的表型和代谢结果，系统地表征了S/T/Y磷酸化在大肠杆菌代谢中的功能。与真核生物形成鲜明对比的是，令人惊讶的结果是大约85%的修饰位点导致表型和/或代谢重排的改变，为功能提供了强有力的证据。总体而言，作者的结果表明，大肠杆菌中的功能性磷酸化位点的比例高于真核生物，并且它们对表型有更直接的影响。
文献链接
https://www.nature.com/articles/s41467-021-25988-4
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