海绵-细菌共培养装置
2019年，Knobloch等人开发了一种海绵-细菌共培养装置，用来分离培养海绵共生细菌，这是一种依靠半透膜分离海绵外植体和微生物的共培养装置。
该装置改良Bio-Dot SF (BioRad)微量过滤器(Bio Hit)作为装置的上半部分，先将海绵外植体切碎放入Bio Hit孔中，再将装置底部每个腔室都充满培养基。
待培养基凝固后，将海绵细菌稀释液接种在每个腔室的培养基上，随后在其上方覆盖一层0.2µm的滤膜和七层25µm的滤纸，最后将含有海绵外植体的微滤器上半部分和装置底部固定在一起，放于海水中进行原位培养。
该装置对海绵共生微生物有显著的富集效果，可以将其置于实验室环境进行培养，也可以将其放入海绵微生物原生环境进行培养，将共培养与原位培养结合应用，但富集后的分离纯培养还需要继续探索。
海绵-细菌共培养装置示意图
单菌落共培养装置
2015年，Tanaka等人设计了单菌落共培养装置，该装置的最外层是培养皿，培养皿内装有聚丙烯隔环和滤膜。
开始将1.5%琼脂培养基铺在培养皿最底层，将再0.4%软琼脂培养基(含有某种待共培养的细菌)铺在凝固后的底层培养基上，随后将带有滤膜的聚丙烯隔环即薄膜过滤器铺在上方，最后在过滤器上方倾倒0.4%软琼脂培养基(含有另一种待共培养的细菌)，上层和下层的菌体共享某些可溶性物质，这些物质可以穿过膜过滤器在各层培养基之间扩散，而菌体则无法穿透膜过滤器，经过一段时间的培养，观察表面菌落的生长状况。
利用单菌落共培养装置成功培养出了之前不可培养的副杆状菌(Parabacteroides)并筛选出多组能够相互促进生长的菌株。
该装置一定程度上克服了人工培养阻碍微生物间通信交流的问题，但并不适用于好氧菌的培养。
单菌落共培养装置示意图
(a)培养皿中膜过滤器整体图(b)共培养系统：1、隔环；2、上层软琼脂培养基；3、0.02µm滤膜；4、下层软琼脂培养基；5、琼脂基层
基于原位培养的培养方法
绝大多数微生物只能在其自然生境中生长繁殖，无法实现实验室生长，原因就在于实验室无法满足微生物生长所需的所有条件，原位培养正是解决这一问题的关键。
微生物原位培养的重点在于将微生物置于自然栖息地进行培养，利用微生物自然生境为其生长繁殖提供所需条件。
近年来，基于原位培养开发的微生物培养装置培养效率可观，挖掘出许多不可培养微生物资源。
DHS(Down-flow hanging sponge)生物反应器
2022,Hiroyuki等人通过使用Down-flow hanging sponge生物反应器(DHS，图5)和选择性分批培养来富集深海不可培养微生物。
该技术最初由Harada研究组开发，这种反应器最初被研制出来是为了处理发展中国家城市污水，是一种高效的废水处理系统。
DHS主体是长113 cm、直径6.5 cm的玻璃管，管中为多个小海绵块连起的海绵柱，玻璃管下管口附近的气孔可通入CH4、CO2等微生物所需的气体，上管口附近的气孔用于废气的排放。
从玻璃管上管口连续灌入培养基，培养基从上至下流经海绵块为微生物供能。
装置使用的海绵具有高孔隙率(>80%)的网状结构，为微生物生长提供了充足的空间，可以在连续缓慢供给新鲜培养基和能量的同时将细胞保留在海绵中。
这种连续流动有助于模拟微生物自然生长环境，人工控制培养基流速，允许持续供应低浓度底物(即稳定的贫营养条件)，同时随着底物的不断流动去除潜在的抑制性废物。
但该装置体积较大，只能在实验室进行原位培养模拟实验；目前关于该装置的报道较少，适用范围有待进一步研究。
DHS生物反应器示意图
Isolation-Tip装置(I-tip)
I-tip装置图
2014年，Jung等人开发了一种微生物原位培养装置Isolation-Tip(I-tip，)，用于从白卡利亚海绵中培养微生物。
使用移液器黄色枪头作为装置主体，枪头尖端用玻璃珠填充以防止杂质进入，枪头中加入70μL 0.7%琼脂便于装置内微生物的增殖。
将装置中富集的细菌用平板法再进行分离培养，该装置结构简单，小巧方便，可将装置插入海绵的不同组织处进行培养，但富集之后的微生物还需要进一步分离纯化。
滤板微捕集器(Filter Plate Micro Trap,FPMT)
2008年，Gavrish等人报道了一种用于分离放线菌的Trap装置。
装置主体是一个外径56 mm，内径35 mm，厚3 mm的尼龙垫圈，在垫圈底部用0.2～0.6μm、顶部0.03μm的聚碳酸酯半透膜覆盖形成密闭空间，圈内空间用无菌的琼脂或结冷胶培养基填充。
微生物在这个空间内生长，后经平板划线分离纯化。
在Trap技术的基础上，2012年，Jung等人开发一种微生物捕捉器(Filter Plate Micro Trap,FPMT)，一种用于从土壤中分离细菌的原位培养设备，由多孔板和孔径为0.45μm膜过滤器组成。
多孔板有96个相互独立的微型圆柱形微生物培养腔室，每个腔室的顶部呈开放状态，底部有直径1 mm的一个孔，孔上覆盖0.45μm亲水性聚偏二氟乙烯(PVDF)滤膜，每个培养腔室最多可以放800μL培养基。
该装置可用于分离土壤中不可培养的微生物，充分阻隔装置内的样品与外界土壤样品的接触的同时又实现了利用微生物原生环境提供微生物生长所需的营养物质，不足之处是只能用于土壤中微生物的培养。
Trap装置图
1、塑料或金属垫圈；2、顶膜过滤器(0.03μm孔径)；3、底部膜过滤器(孔径0.2-0.6μm);4、琼脂或凝胶
过滤微孔板示意图(A) FPMT示意图
扩散室和分离芯片
扩散室和分离芯片(ichip)是早期探索环境中不可培养微生物的经典成功尝试，虽然不是近十年出现的新技术，但到目前为止，依然有新的微生物资源被ichip发现。
2002年，Kaeberlein团队设计了一种扩散室[50](diffuse chamber)，用于培养海洋潮汐带沉积物中的微生物。
装置由一个有中央通孔的金属环和紧贴在两侧的0.03μm半透滤膜构成。
将含有微生物的原生境样品与琼脂混合后注入密封空间内，然后将其返回微生物的自然栖息地培养。
近些年开发的微生物原位培养装置都或多或少受到了扩散室的启发。
扩散室示意图
经过不断优化，该团队于2010年设计了类似于扩散室的高通量分离装置，称为分离芯片(ichip)。
该装置主体由多通孔中心培养板和半透膜组成，中心板的两侧覆盖聚孔径为0.03μm的碳酸酯薄膜，将带有匹配通孔的盖板拧紧以密封系统并将膜进行固定，防止通孔中微生物细胞随意进出，同时允许环境中营养物质的扩散和微生物间的交流，将ichip放回微生物自然生境培养。
样品采集并悬浮在液体琼脂中,稀释悬浮液，以确保每个ichip通孔中进入一个细胞，待琼脂固化后，微生物细胞便被固定在通孔中。
培养板上具有多个相互独立的通孔，每个通孔中只有一个微生物细胞，减少了微生物间的竞争拮抗作用，又保证了微生物间的交流。
分离芯片相对于扩散室的进步之处在于ichip是由数百个微型扩散室组成的，具有多个相对独立的培养腔室，可以实现微生物的高通量培养，可以实现单个微生物单独培养，而扩散室只有一个培养腔室。
分离芯片ichip示意图
目前，研究者们已将ichip成功应用到多种环境微生物的分离培养，ichip相比上文中提到的其他微生物培养方法被更广泛的借鉴和应用。
2022年ichip成功分离出在生物修复中具有重要作用并且能够耐受和降解三丁基锡(TBT)的Oceanisphaera sp.
2020年ichip成功培养出原本不可培养的海洋细菌Gallaemonas mangrovi HK-28;2019年ichip成功驯化1株产生一种新的N-酰基酪氨酸的海绵细菌Alteromona sp.RKMC-009;2015年ichip成功驯化1株产生一种新型抗生素Teixobactin的原本不可培养土壤微生物Eleftheria terae[57]等等，这些成功的实践证明了ichip在微生物培养中的重要作用，也突显了隐藏在不可培养微生物中的各种新的代谢途径的潜力。
基于细胞分选的培养方法
不管是对可培养微生物的培养还是对不可培养微生物的培养，先对微生物细胞进行分选，再根据分选结果有针对性地选择合适的培养方式，这无疑会提高微生物的培养效率。
细胞分离后培养通常比混合培养后分离更有效，细胞分选技术的出现创造了微生物细胞先分选再培养的策略，大大提高了微生物的培养效率。
激光喷射单细胞分选
目前，细胞分离技术种类繁多，单细胞喷射技术是应用面最广的技术之一。
单细胞喷射技术的原理是应用激光诱导前向转移(LIFT)技术来分离细菌，LIFT技术的原理是当激光脉冲照射在涂层表面时，涂层会吸收激光能量而汽化，涂层上的材料(含有微生物细胞)会在加热引起的气体压力或激波下被推开。
为了使细胞尽可能长时间存活，2022年Liang等人提出了一种三层LIFT系统(图11)，顶层：25 nm铝膜；第二层：厚度为3μm的琼脂培养基；第三层：含细菌的液体。
激光束穿过显微镜物镜后聚焦于顶层的铝膜上，铝膜吸收激光脉冲，受热形成推力，推动第三层细胞移动，第二层琼脂可以保护细胞免受铝膜加热的损伤。
该装置成功用于分离和培养单一革兰氏阴性(Escherichia coli)、革兰氏阳性(Lactobacillus rhamnosus GG[LGG])和真核(Saccharomyces cerevisiae)微生物，优点是可以实现微生物单细胞的分离，不足之处是需要复杂的光学仪器辅助分离。
用于单个微生物分离和培养的激光诱导正向转移(LIFT)系统示意图
(a) L1至L：透镜；HP：半波片；PBS：偏振分束器；S：快门；M1至M4：反射镜；DM1：分色镜；MO1至MO2：显微镜物镜。
(b)三层结构。
第一层，吕膜；第二层，固体培养基；第三层，液体培养基]
二维细胞分离
2022年，Krishna等人利用梯度离心结合串联稀释的方法进行二维细胞分离，对分离后的微生物细胞进行培养。
具体方法是，将采集的土壤样品涡旋2 min，使微生物细胞与固体颗粒分离，悬浮液在不断增加的离心力下进行连续多轮离心。
将从每一轮离心中获得的上清液在更高的离心力下进行下一轮离心，将每次离心后获得的沉淀重新悬浮，连续稀释后进行平板培养。
Krishna等人证明，与单独使用串联稀释相比，梯度离心结合串联稀释从环境样本中分离出的微生物属的数量和种的数量明显增多。
该方法在不使用复杂仪器的情况下提高了微生物的可培养性，不足之处是操作较为繁琐，需多次重复离心和稀释；目前应用该方法的报道较少，还需要进一步探索。
二维细胞分离(2DCS)方法的图示[
自动化微生物微滴培养系统
随着对微生物培养方法的深入探索，全自动微流控一体化相关技术出现，实现了微生物从培养、检测到筛选的集成化，大大提高了微生物的培养效率。
2021年，清华大学团队成功开发了一款基于液滴微流控技术的全自动高通量微生物微液滴培养系统(Microbial microdroplet culture system,MMC)，该系统包含液滴识别、液滴光谱检测、微流控芯片、进样等多个功能模块，成功地实现了微生物液滴培养过程需要的接种、培养、监测、传代、筛选等功能的集成化。
MMC系统中每个液滴体积为2–3μL，整个系统有200个液滴培养单元，相当于200个摇瓶培养同时进行。
通过微流控芯片T形通道形成精确可控的微液滴，液滴从生成开始，通过液滴识别系统对每个液滴进行编号，根据培养过程微液滴OD检测数据实现目标微生物微液滴的分选，获得的微生物根据需要进行后续培养与分析。
MMC系统大大提高了微生物的培养效率，实现了微生物从接种到筛选的一体化培养，设备结构精细复杂，但目前只完成了系统底层单元操作的开发。
本文以实现微生物培养为目标，综述了十余年间微生物培养的创新方法及实例。
从这些实例中总结出微生物培养方法发展的三大趋势。
一是细胞分离技术在微生物培养中发挥着越来越重要的作用；二是基于微流控技术的微生物高通量培养优势显著；三是多技术联合使用，以原位培养和共培养为原理，出现了多种新型微生物培养装置和反应器，如细胞分离技术结合稀释培养、ichip结合共培养、高通量原位培养装置等。
随着越来越多的新型综合培养技术和装置出现，微生物的培养效率也在不断提高。
一些难培养或不可培养微生物的成功分离培养，为微生物资源的开发利用注入了新的活力。
未来对于微生物培养方法的探索，我们认为可从以下几方面展开：(1)优化和改进现有的微生物培养方法；(2)开发更有效的不可培养微生物的培养方法。
充分研究已经成功培养的原本不可培养微生物的生存机理，寻找不可培养微生物难以培养的原因；(3)多技术多方法联合使用。
传统培养法与新型培养法、多种新型培养方法有机结合，取长补短。
(4)开发更加成熟的微生物培养、检测和筛选集成化装置，这必将帮助我们探索各种极端无人环境中的微生物，获得更多特殊又珍贵的微生物资源。
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