文 | 雨燕的小世界
编辑 | 雨燕的小世界
-＜前言＞-
杨树属是公认的分子树生物学的模式系统。为了研究杨树的基因功能，建立稳定的转基因株系是功能遗传学研究的常用技术。然而，由于漫长的转基因过程，有限数量的基因被靶向。
瞬时转化法与稳定转化法相辅相成，在体内快速评估基因功能方面具有显著优势。
我们的目的是开发一种简单有效的杂交白杨瞬时转化方法，并为其在功能基因组学方法中的潜在应用提供参考。
-＜介绍＞-
杨树属包括杨树、白杨和棉杨，可以作为多年生木本植物的模式生物。
杨树具有基因组小、全世界有30多种、幼树生长快、易于无性系繁殖、遗传转化和再生简单、遗传图谱广泛等潜在的生物学优势。
黑棉的第一个基因组草图于2006年发表，首次提供了对树种基因组组织的见解。
基因组包含超过45000个蛋白质编码基因，约12%的基因与模式植物拟南芥中的基因没有相似性。为揭示杨树基因的生物学功能，通过对杨树转基因树的生成和鉴定，对多年生木本植物的独特特征、生活方式和生物组织进行了深入的了解。
然而，由于漫长的转化过程和每个构建体需要对许多转基因系进行表征，有限数量的杨树基因已成为转基因研究的目标。
瞬时转化法是对稳定转化法的补充，使基因功能分析更加高效。瞬时基因表达技术可用于拟南芥和水稻等模式植物以及玉米、马铃薯、大豆、番茄和小麦等作物植物。
在杨树中，一些研究成功地通过生物轰击、原生质体转染和农杆菌共培养证明了瞬时基因表达。
例如，在杂交杨树中，通过粒子轰击，叶片表皮和保护细胞瞬间转化为报告结构。
采用电穿孔法或聚乙二醇化学法对杨树叶组织原生质体和悬浮培养细胞进行瞬时转染。在稳定转化体再生之前，采用农杆菌共培养的方法检测了黑孢霉、毛毛霉和毛卡霉中报告基因的异位表达。
然而，这种转化分析有一定的缺点，例如需要昂贵的设备和与粒子轰击有关的用品。此外，杨树原生质体转染的转化效率相对较低，仅从幼苗中分离出一小块组织用于农杆菌共培养。
为了避免这些缺点，另一种瞬时试验，如农杆菌介导的渗透，将对杨树有用。该方法对拟南芥、葡萄、马铃薯、柳枝稷、烟草和番茄等几种植物进行转化，转化过程简单，操作简便，转化效率高。
瞬时转化技术可用于快速体内基因功能分析，如蛋白质亚细胞定位，蛋白质-蛋白质相互作用和启动子活性。
对于体内功能分析，报告基因如绿色荧光蛋白、GFP变体和萤火虫荧光素酶是分子和细胞生物学研究的常用工具。蛋白质亚细胞定位对于阐明蛋白质的细胞功能至关重要，可通过荧光融合蛋白的瞬时表达进行监测。
含有目标基因的报告基因构建体与GFP或其变体融合，并瞬间转化为植物细胞，通过报告基因的荧光可见细胞内定位。
荧光蛋白也用于体内蛋白质-蛋白质相互作用，如双分子荧光互补和荧光共振能量转移，可以可视化蛋白质-蛋白质相互作用和靶蛋白的亚细胞定位。
两种不同构建体的瞬时共转化技术是一种方便和实用的替代双转化转基因植物的方法，并允许测试几种构建体和组合。
除了荧光蛋白外，LUC还被用作报告基因，主要用于测量转录活性。与荧光蛋白相比，LUC报告蛋白具有相对较短的半衰期，因此适合于实时监测基因表达。
例如，生物钟相关基因的表达模式通过LUC报告基因分析得到了广泛的研究。
通常，这些检测使用生物发光来可视化表达由转基因植物的时钟启动子驱动的LUC基因的昼夜或昼夜节律。虽然关于植物时钟系统的研究主要是使用稳定的变压器进行的。
-＜瞬态转化＞-
我们首先研究了用于烟草品种的注射器注射技术是否适用于杂交白杨叶片。
用钝头塑料注射器将浸润介质和5 mM MEsKOH 注入在土壤中生长1个月的全张杨树叶片的背面表皮。培养基在注射器接触区域周围渗透，但由于叶脉网络的限制，其渗透范围更广。
接下来，我们研究了农杆菌介导的真空渗透是否增加了杂交杨树叶片渗透介质的渗透率。
简单地说，在无菌琼脂培养基中生长的杂交杨树插枝被淹没在有或没有农杆菌的溶液中0.003% Silwet L-77，然后真空浸润。
在低压真空和洗涤剂的帮助下，渗透溶液渗透到整个白杨叶子中。因此，我们可以开发一种真空介导的农杆菌渗透技术。
利用二元表达载体pPZP221CaMV35S::EmGFP在A. tummefaciens菌株GV3101 中的瞬时转化监测。农杆菌细胞生长至固定期后再悬浮于浸润培养基中。
真空浸润使用三到四周树龄的白杨插枝，不去除任何组织。当使用与根组织分离的芽时，渗透培养基不能从叶片的细胞间隙中蒸发出来，很少有细胞成功转化。
转化3天后，GFP信号主要在幼叶中观察到，分散在单个细胞中。大部分转化细胞集中在叶片的中部到顶端。
尽管将完整的植物浸泡在细菌溶液中并真空浸润，但叶柄、托叶、茎和根中很少有细胞具有GFP信号。
在叶组织的表皮细胞、保护细胞、叶肉细胞等多种细胞类型中均检测到GFP荧光。该结果表明，农杆菌介导的真空浸润技术可用于分析嫩叶细胞。
在拟南芥农杆菌介导的浸润试验中也描述了组织依赖性转化的有效性，其中幼子叶比叶柄和根的转化程度更高。在接下来的研究中，我们主要使用嫩叶来监测转化细胞。
-＜条件＞-
对浸润介质、Silwet L-77浓度、细菌生长阶段、细菌密度等转化条件进行优化。利用其他植物物种进行的研究报告称，这些条件会影响农杆菌渗透技术的瞬时转化效率。
我们首先估算了渗透介质对转化效率的影响，试验了两种培养基：
（1）在农杆菌介导的拟南芥真空浸润中建立的10 mM MgCl2和5 mM MES-KOH；（2）在杂交白杨培养基上建立的0.5 × MS培养基和5 mM MES-l KОH。
将饱和的农杆菌过夜培养物重新悬浮在含有200 μM乙酰丁香的培养基中，然后稀释至最终od600 = 0.5。
然后，在真空之前，在溶液中加入0.0075%的Silwet L-77。真空浸润3天后，在小隔间中扫描并计数嫩叶中GFP阳性细胞，以评估转化效率。
在MS溶液中转化的叶片每隔室有14.6±1.2个GFP阳性细胞。然而，在氯化镁溶液中转化的细胞较少。因此，我们决定使用MS介质来进一步估计瞬态变换。
其次，研究了表面活性剂Silwet L-77浓度对瞬态转化效率的影响。表面活性剂的存在可以使细菌溶液渗透到叶腔中，提高瞬时转化效率，但过量的表面活性剂会加速拟南芥叶细胞的坏死。
正如预期的那样，在缺乏Silwet L-77的培养基中转化后，很少有细胞显示出GFP荧光，因为溶液对叶片的渗透受到限制。Silwet L-77浓度与转化效率呈正相关，当Silwet L-77浓度为0.015%时，转化细胞数最高。
然而，在含有0.03% Silwet L-77的培养基中，叶片细胞表现出微弱和较少的转化。
在与农杆菌共培养的拟南芥瞬时转化中，有报道称转化效率与浓度也存在类似的正相关关系，且在农杆菌溶液浓度为0.005%时，转化效率达到峰值。
白杨扦插的表面活性剂浓度是拟南芥的3倍；这种差异可能是由于不同物种之间的叶片结构和年龄不同。此外，转换过程也各不相同。我们将农杆菌溶液的浓度固定在0.015%。
-＜亚细胞定位＞-
瞬时转化试验的主要应用之一是观察细胞中蛋白质的亚细胞定位模式。一些研究已经应用瞬时转化技术来监测杨树蛋白在异源植物系统中的亚细胞定位。
然而，同源杨树的定位研究很少，因此，我们利用农杆菌介导的真空浸润研究了同源植物系统中杨树蛋白的亚细胞定位。
此次检测了四个杨树基因——肉桂酸4羟化酶、GT47C、MTP1和PrxQ的细胞内定位，这些基因之前在异源植物表达系统中被描述。
利用农杆菌介导的真空浸润将c端GFP标记蛋白的表达载体瞬时转化为杂交杨树插枝。
PttMTP1蛋白是一种液泡锌转运蛋白，定位于液泡膜的环状结构。瞬时转化方案的结果在亚细胞定位方面显示了可靠性，选择用于测试靶向不同细胞区室的蛋白质。
-＜基因检测＞-
我们在瞬态LUC报告基因试验中定位了杨树下LHY2基因的启动子，该基因是植物生物钟系统的关键因子。
通过农杆菌介导的真空浸润，将PttLHY2启动子:luc转化为杂交白杨幼苗。在光照、暗循环下每隔1小时检测LUC活动，持续2天。
在茎尖和幼叶中，LUC表达较强。在叶片中，折叠幼叶中的LUC活性高于展开叶和展开叶。
反映PttLHY2基因表达的生物发光表现出昼夜节律，节律高峰出现在黎明后1-2小时。转化后的白杨顶端的典型昼夜表达持续了两天，尽管第二天的发光水平有所降低。
杨树LHY2基因的昼夜节律在以往的研究中也有报道；这些研究使用real - time PCR技术检测了表达水平。与Real-time PCR测定的昼夜节律相比，瞬态LUC检测可以监测到更多的LHY2表达的急性高峰。
-＜结论＞-
我们开发了一种新的杂交杨树插枝瞬态转化试验。对于杨树物种，这种简单的测定方法比传统的瞬时测定方法具有更高的通量。
此外，该方法可用于蛋白质亚细胞定位、蛋白质-蛋白质相互作用和体内启动子活性的快速功能分析。
虽然该技术在野生型植物中进行了优化，但它可以应用于稳定的转基因白杨，使双突变体的产生无需额外的长期转化过程。
因此，瞬时转化试验将有助于同源植物系统中不同属杨树基因的功能分析。
