之前学习了别人空间转录组不同样本的研究，相信大家都很好奇不同样本要拿到优秀的空间转录组测序实验结果，应该做哪些准备工作呢，样本制备可是至关重要的一环！小白根据10x Genomics资料整理了空间转录组的样本制备指南，这期就让我们首先来看看冰冻样本准备的操作流程吧。
新鲜组织选取和预处理
1. 组织大小：空间转录组Visium芯片的捕获面积为6.5mmX6.5mm，所以在选择样本前，首先确认好最佳的取材位置及合理组织大小，保证Visium芯片的有效利用率。
2. 新鲜组织样本取下后迅速用预冷的PBS溶液或者生理盐水冲洗组织表面残留，然后用干净的吸水纸吸干液体。（此步骤一定要吸干水分，如有液体残留，OCT包埋后，组织表面形成冰晶，影响切片效果）
3. 保持整个取样过程在低温中进行可以延缓核酸的降解。
方法一：直接包埋
适合手术下来的组织，能尽快包埋的实验场景。简单，快捷。
1. 组织修剪成合适的大小，用预冷的PBS冲洗两次，尽量把血水冲洗干净。使用实验室纸巾将组织表面多余的血液或液体吸干净，防止形成冰晶。
2. 模具中倒入一点预冷的OCT，再将新鲜组织转移至 OCT模具中，可以轻轻的调整组织位置，之后继续倒入预冷的 OCT，直至浸没组织。模具上标记好方位。
3. 将有组织的模具轻轻移入干冰粉末上或者预冷的异戊烷中，直至 OCT 完全冻结成白色。
4. 将 OCT 包埋的组织块，直接放入-80℃长期保存，或立即进行下一步操作。冷冻的包埋样本在–80℃冰箱可以长期保存，或干冰运输至云准实验室，或立即进行下一步操作。
OCT 包埋的组织运输
1. 冷冻的样本，或者包埋好的样本，都要埋在干冰里面进行运输，不能冻融。
2. 冰盒为 5cm 以上厚的泡沫箱，加盖。
3. 干冰重量要求，根据寄送时间，约5 kg/日。
方法二：先冷冻再包埋
适合手术下来的组织不能立即包埋的实验场景，为了能保证组织中RNA不降解，可以先冷冻之后再包埋。
一．新鲜组织速冻
1. 将药匙、冻存盒等在干冰中预冷。向金属杯内装入2/3 的异戊烷（完全浸没组织的量），然后将金属杯放入液氮槽中，液氮的液面和金属杯里面异戊烷的液面高度基本一致，冷冻 15min。
2. 组织修剪成合适的大小，用预冷的PBS冲洗两次，尽量把血水冲洗干净。再使用实验室纸巾将组织表面多余的血液或液体吸干净，防止形成冰晶。
3. 用镊子或刮刀将组织放入异戊烷中，直到完全浸没。组织浸入约1min或直至冻结。冷冻时间根据组织类型和大小而定。
4. 将冷冻后的组织转移到预冷的冻存管内，然后放在干冰上，及时转移至-80℃冰箱。
二．包埋冷冻组织
1. 标记适当尺寸的包埋模具以标记组织的摆放位置。
2. 从–80℃冰箱取出冷冻组织，干冰转移，并放在干冰上待用。
3. 预冷的OCT倒入模具，不要产生气泡。
4. 使用预冷的镊子将冷冻组织放入OCT包埋剂内，组织需完全包埋在OCT 内，需确认无气泡产生，尤其是靠近组织的位置。
5. 将 OCT 包埋组织的模具立即转移到干冰粉上，继续倒入预冷的OCT，直至把组织覆盖。
6 在干冰上等待 OCT 完全冻结成白色，冻结后的包埋样本标记好名称，放在自封袋里面，及时转移至-80℃冰箱。
Note：冷冻的包埋样本在–80℃冰箱可以长期保存，或干冰运输至云准实验室，或立即进行下一步操作。
方法三：客户自己切片
适合组织样本拿不出您的单位，或者客户有特殊的切片要求，需要自己完成切片和贴片的实验场景。
一．RNA 完整性检测：
自行切5-10片10μm的切片，干冰寄送至云准实验室，抽提RNA进行RIN值检测，合格后，云准会常温给您寄送透化玻片。
二．透化检测：
Visium组织优化玻片中，在8个捕获区域中的7个区域放置切片，留下一个空白区域用于RNA阳性对照。贴好的透化玻片，干冰运输回云准实验室，进行后续实验，发送透化报告，根据透化报告，决定是否进行正式实验。确定的话，云准会常温寄送正式玻片。
三．正式实验：
我们给您寄正式的Visium捕获芯片后，必须一次做4个样本，切片需要贴在固定捕获区域范围内，干冰运输回云准实验室，进行后续建库实验，出具文库报告，没有异常就进行测序。
(左)组织优化玻片，捕获区域8*8mm
(右)基因表达玻片，捕获区域6.5*6.5mm，由8*8mm基准框架包围
切片注意事项：
1. 预冷切片机，设置样本头温度，刀片（箱体）温度，切片厚度：一般组织切片都是10μｍ，箱体温度调节为-20℃，样品碟的温度为-10℃。具体设置可以根据实际组织情况调整，如组织的脂肪含量高应适当增加组织厚度。提前将玻片、装有OCT包埋组织的冻存盒和玻片盒放入箱体中平衡温度。
2. 在样本碟上涂上常温OCT，将修剪好的冻存OCT包埋组织块放在上，然后将样本碟与OCT整体转入样本箱的速冻架上，使OCT包埋块固定在样本碟上。
3. 将样本碟固定在样本台上，转动把手进行修片，修去多余的OCT，使组织暴露。
4. 开始进行切片，获得满意的切片后，缓缓用力将其分离。将切片完全展开，用预冷的Visium玻片贴在切片上，使切片落在玻片的目标区域。
5. 将手指放在切片另一侧的玻片上，用手指的温度使切片融化，使其贴在Visium玻片目标区域上。
6. 将Visium玻片放在冷冻台上，使切片重新冷冻。继续转移剩余捕获区域的部分。
7. 将附着切片的Visium玻片放置在预冷过的玻片容器中；如不直接进行后续实验，可在-80℃冰箱中最多保存7天。不要使其暴露在室温环境下，可能会使生成冷凝水，产生冰晶，破坏组织。
冷冻切片玻片运输注意点：
1. 将包含组织的玻片放到预冷的玻片邮寄盒或50 ml离心管中，放在干冰上。如果要运送多张玻片，请将每张玻片放在单独的玻片邮寄盒或50 ml离心管中并尽量保持干燥。
2. 将玻片邮寄盒或离心管在干冰上放到塑料袋中，以确保将其完全密封。
3. 运输过程保证包裹加够足量干冰。
4. 收到包裹后，我们会将玻片在干冰上运到-80℃进行存储，直至开始实验前。
样本到样后质检
RNA 完整性检测：
样本到样后，我们会先取组织切片进行RNA提取，然后进行Agilent2100检测，检测结果良好（RIN 值应大于7，说明RNA质量比较好，样本采集及样本制备没有造成额外的降解）可以进行后续的实验。
上图显示的样本来自完整（蓝色，RIN=9；绿色，RIN=10）和 严重降解（红色，RIN=1.4）的RNA
组织形态学检测：
1. 方向是质检中另一个非常重要的参数，横切，纵切，矢状切，一定要找到目标区域，切片贴片后H&E染色，扫描，根据HE图像，确定方位继续后面的实验。
2. 观察组织形态上是否完整。如果新鲜组织样本表面液体没有吸干，直接进行冻存切片会在组织周围产生冰晶，增加组织脆性，不易切片成功，或者HE染色成像后出现条状裂纹。OCT包埋如果不注意处理气泡，切片时会出现空洞现象，造成切片不连续，影响切片质量。
Tips
1. 目前10x官方已测试支持的样本类型：
人类：脑、乳腺、乳腺癌、心脏、肾脏、大肠、肺、肺癌、淋巴结、卵巢、脾、脊髓等
小鼠：脑、眼睛、心脏、肾脏、大肠、肝、肺、卵巢、四头肌、小肠、脾、胃、睾丸、甲状腺、舌等
大鼠：脑、心脏、肾脏等
斑马鱼：幼体
具体信息可以查询10x Genomics官网：https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/tissue-optimization/doc/specifications-visium-spatial-gene-expression-optimized-tissues
有一些样本是不推荐做的：骨头，胰腺，脂肪含量高的组织。
2. 对具有缝隙、易于卷曲的组织推荐 OCT 包埋再冷冻。
3. 新鲜组织样本必须进行快速冷冻以防止RNA 降解，如组织直接放入液氮后会沸腾，在组织周围产生气穴，导致组织降温过程中不同区域降温不同，改变组织内部形态甚至碎裂，影响组织切片效果。用异戊烷或者干冰冷冻后进行OCT 包埋，是对组织形态和防止 RNA 讲解最有利的保护。如果没有异戊烷，可以跳过该步骤，直接将新鲜组织进行OCT包埋后速冻。
4.对于组织量较少的样本也是可以做空转实验的，比如穿刺样本，一般会建议同一个样本准备2份组织，一份组织用来质检，RIN值合格的话，再用另一份样本进行透化和正式实验。
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