混合菌种的固定化可分为活性污泥的固定化和经过筛选的混合菌种的固定化两种。
1．活性污染的包埋法固定化
把好氧生物处理中的活性污泥用一定的包埋方法进行固定化，从而得到具有一定形状的、能降解BOD能力的固定化细胞体系。包埋活性污泥时使用的包埋剂与一般细胞包埋剂相同。从包埋后的强度和成本上看，聚丙烯酰胺和聚乙烯醇较好，但从对活性污染中微生物的毒性方面来看，海藻酸钠和琼脂较好。
包埋时使用的活性污泥，一般取自城市污水处理厂的曝气池中，用自配废水进行一定时期的驯化培养，经离心洗涤后包埋。被包埋活性污泥的浓度因使用的包埋剂种类不同而不同，一般使用80～100g/L的活性污泥浓缩液。在活性污泥的固定化中，由于污泥中的微生物是被包埋在凝胶材料内部，所以氧的传递会受到一定的阻碍，不利于好氧菌的生长。一般包埋法活性污泥有可能在下述几方面获得成功：①低浓度有机物的快速分解，如生活污水的高效处理；②在低温下达到较好的BOD去除率；③高效脱氮、硝化等。
2．经筛选的混合菌细胞的包埋法固定化
把经过富集培养筛选得到的混合菌系用一定的包埋方法加以固定，从而得到对特定污染物有高效降解作用的固定化细胞体系。这种方法可以将选育出的高效降解菌系或专门降解某种难于生物降解有机物的菌系，以很高的浓度包埋在凝胶材料中，人为地使这些菌种成为优势菌，并且不会随污泥的排放而消失，使所选育菌种高效地发挥作用。
例1 琼脂凝胶包埋产甲烷菌群用消化污泥作接种源，接种于富集培养基内，经20天富集，离心收集产甲烷菌群细胞进行包埋。包埋时取0.02g湿细胞，加入含有0.02g琼脂的1ml生理盐水（50℃），混合后快速降温至37℃，得到琼脂包埋的产甲烷菌群固定化细胞。琼脂凝胶的结构保护了产甲烷菌和产氢细菌免受氧气的侵害，因此固定化细胞在好氧条件下也可以连续产甲烷。由于产氢细菌和产甲烷共同包埋在琼脂凝胶中，因此前者产生的氢气能够有效地被产甲烷菌利用。这种固定化细胞在5℃ 0.1M pH为7.0的磷酸缓冲液中保存90天，产甲烷速率没有发生变化。
例2 聚乙烯醇包埋降解洗涤剂LAS的菌系取生活污水厂的污水按1％的接种量接种到富集培养基内，在转速为133r/min、30℃的恒温摇床中培养30小时，将富集菌液在经过4000r/min下离心20分钟，去掉上清液，将湿菌泥与一定浓度的聚乙烯醇混合均匀，细菌容量在混合液中为5.36％；聚乙烯醇浓度在混合液中为12.5％。将混合液滴加到冷却的饱和硼酸液中，静置30小时后取出小球，用清水冲洗，用滤纸将小球表面的水分吸干，然后固定化细胞即可进行降解LAS的试验。试验表明，这种固定化细胞对LAS有很强的降解能力，而且聚乙烯醇固定化细胞机械强度很好，可以保存，在间歇式运行中几乎没有污泥产生。
例3 琼脂包埋降解苯酚的细菌用厌氧消化器中污泥作接种泥，接种于富集培养基中，经过每两天向富集培养液中加入一定量的苯醛进行富集筛选后，获得3个生理型细菌菌株：苯酚氧化菌、类产甲烷丝状菌和利用氢的产甲烷菌。然后将这3类细菌一起包埋在琼脂中，包埋要在厌氧条件下进行，琼脂浓度为2％。琼脂的细菌混合后，采用自然冷却固化，得到固定化细胞，再进行苯酚降解活性的试验。试验表明，琼脂凝胶结构对固定化细胞有保护作用，对苯酚的耐受力比自然细胞大，苯酚浓度大于500μg/ml时，自然细胞对苯酚降解速度下降，而固定化细胞只有苯酚浓度在1000μg/ml以上时对苯酚降解速率才下降。当苯酚浓度在2000μg/ml时，自然细胞的降解活性完全被抑制，而固定化细胞仍有一定的活性。可见固定化对于有毒有机物的降解以及抵抗高浓度有毒有机物对微生物的抑制是有益的。
三、微生物酶与细胞共固定化
利用交联剂将微生物细胞与一种或几种其他来源的酶结合起来，形成一种结合型的固定化催化剂。这种共固定化技术可以充分利用细胞和酶各自的特点，并能把不同来源的酶和整个细胞的生物催化性质结合起来，充分发挥细胞内、外两种不同性质酶联合催化性质，而且方法简单，成本低，固定化颗粒小，比活性高，热稳定性好，氧利用效果好，产物转化效率高。
用碳化二亚胺作交联剂，把酶共价结合到海藻酸钠上，然后加入微生物细胞混合均匀后，滴加到氯化钙溶液中，形成直径为2～3mm含有细胞和酶的共固定化颗粒。也可将脱水后的微生物悬浮在要结合的酶溶液中，使酶沉淀在重新水化的细胞壁上，然后脱水，再加入戊二醛和单宁，使酶与细胞交联在一起，形成共固定化。
将微生物细胞体用去离子水离心洗涤2次，然后再用异丙醇在5℃下处理，以增强透性，而后在30℃下真空干燥，得5g干细胞体，然后用边搅拌边悬浮的方法使其悬浮于50ml含有0.4g的卵清蛋白和20ml酶浓缩液（酶活为2600BU）中，接着再添加80ml异丙醇和8ml戊二醛（25％W/W）混合物，并在25℃下振荡培养2小时，离心或过滤收集细胞体，再用去离子水于5℃下洗涤2次，再悬浮于0.1M柠檬酸0.2M磷酸缓冲液中，就可获得酶——细胞结合型固定化生物催化剂。
思考题
1．微生物细胞的固定化技术有哪些？各自有何特点？
2．海藻酸钙凝胶包埋法的操作步骤与注意事项有哪些？
