将某一真菌与自然界的其它真菌分离开，而成为单一的纯菌株，就是菌种分离。要栽培食用菌，就要首先得到所要栽培菌的。分离工作应该是在很清洁的无菌环境下进行。无菌操作间或无菌操作箱，是不可缺少的设备。无菌操作间或无菌操作箱在工作前，事先要进行灭菌和消毒处理，通常是先在室内喷洒水雾以消除悬浮在空气中的尘埃及微生物，然后配制2%的煤酚皂液，或1：40福尔马林溶液喷酒消毒，或者可用高锰酸钾加上乳酸后产生蒸汽消毒。无菌操作室中或无菌操作箱内装置紫外光灯，则更能保证其灭菌状态。
除工作环境外，工作人员应保持自身的清洁，在工作前应用肥皂水洗手，有条件时应穿上灭菌后的工作服并带日罩。对分离材料处理：因食用菌有特殊的子实体，所以分离菌种时可利用其子实体进行直接分离，在分离前要将材料进行无菌处理。外表消毒用75%的酒精擦外表或用0.2%的升汞液浸泡3~ 5分钟，再用无菌水冲洗7 ~ 8次，以达到分离材料外表不带杂菌。具体分离有下列3种方法：
（1）.组织分离法 选择子实体肥大，无病虫害，经济性状好，产量高，质量好的个体作为分离材料，用小刀在子实体上取一小块菌肉，移放在斜面培养基中央，放在25一27℃的恒温箱中培养2~3天，组织块上长出白色菌丝，移植到斜面进行纯化培养。当菌丝长满培养基后，再移植纯化到新的培养基中，培育成母种。
（2.）孢子分离法 把采选的子实体用无菌水冲洗数次，用无菌纱布吸去表面水分，在接种箱中用经过消毒的钢丝钩上，悬挂或悬空于锥形瓶或钟罩中，送入恒温箱中保持20--26℃的温度，培养1~2天后，就看到培养基上有微暗的灰粉出现，就把子实体移出，让孢子在培养基上发育成菌丝，再移到试管培养基上，即得到母种。
（3.）基质分离法 又称为寄主分离，是从食用菌着生的原基上，取一段木头，从段木中分离提取菌丝，经纯化培养后，获得菌种。方法是把子实体着生部位去皮截取一块木头，用0.2%的升录液浸过，用无菌水冲洗、擦干，用刀刮去表层，切割火柴杆粗细的一点，放入三角瓶内，经5天培养就看到小木块周围白色的菌丝，待蔓延后，再经纯化转到新的培养基进行培养，即得到纯净的菌种，但必须进行出菇观察试验。
（4）扩大培养 我们用上述3种分离法得到的纯菌经出菇试验观察，可按生产规模及栽培研究的需要，扩大对菌种的繁殖。
5.原种的制备：
将分离得到的母种，放入木屑培养基中进行扩大培养即成原种。木屑培养基成份：阔叶木屑75%，细米糠（或麦获）22%，糖1.5%，石膏粉1.5%。加入适量清水，除松、杉、柏、樟等树木的木屑含有对香菇菌丝生长有害的树脂、树脂酸、精油等物质不能直接利用外，其它阔叶树木的木屑一.般均可使用。目前多用棉子壳、甘蔗渣、麦秆草等代替木屑使用的。
制法：木屑、麦麸、石膏粉按上述比例拌匀；然后加入已溶有糖的水，搅拌均匀，使培养基含水量达到60--65%。搅拌好后即可装瓶，培养料装入瓶中边用力振动瓶子，同时用扁形铁钩将培养料表面压平，料至瓶肩，用水洗去瓶内外之未屑，并用一圆木棒将瓶内培养料打一洞至瓶底。然后瓶口塞好棉塞并包上牛皮纸及时进行高压灭菌。一般在17磅压力灭菌1小时。在没有高压灭菌锅时，也可用木慨子连续蒸7~ 8小时也可达到灭菌目的。
灭过菌的瓶子或培养料，待冷却后放入接种室（箱）内，在无菌操作的条件下将斜料面上长好的母种接人木屑培养料，约接1厘米的种量为宜，接好种置于20--25℃下培养。生长正常的情况下约一个月左右菌丝就可长到瓶底部或长满整个培养料块。将长满菌丝的木屑培养基移至阴凉通风处放置，这就是食用菌的原种。一般在低温下可保存4--6个月。在生产上需要原种量较大，一般可用原种再接到木屑培养料上进行扩大原种生产，一瓶原种可扩大接种到70--100瓶，由原种扩大生产的菌种为栽培种。
食用菌种的保存是一重要的问题。保存的目的是为以后继续研究和生产上的应用，因此，保存的方法是使菌种在长期内置放不致于死去，同时还要尽可能使菌种能保持原有性状。菌种保存的方法很多，可根据研究或生产应用的需要，要求保存时间的长短，菌种本身情况，灵活选择其方法：
（1）临时保存法对于暂时还不接种的菌种可采用，将酒种移植在斜面试管中，待菌落充分生长后，用软木塞或橡皮塞将管口塞紧，这样可以较长时期培养基不致干燥，用起来也很方便。
（2）冰箱保藏法将菌种接种在固体斜面培养基上，待菌落充分生长后，放在4℃的冰箱中进行保藏。每隔一定时间转接一次。一般用这种方法可以保存半年左右。
（3）地窑保藏法挖一米深的地窖，窖内放一个缸，在大缸内再放一个小瓦缸，在大小瓦缸间隙周围放河沙，用井水把河沙浸湿。井水要经常更换。在小缸中放几个大口瓶，把要保存菌种放入大口瓶中，然后盖上玻璃瓶口，盖好缺口保存时间约3个月到半年。
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