原创 eryun 云生信学生物信息学
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很多小伙伴可能已经发现“纯生信”文章内卷越来越严重了，小编也经常会收到小伙伴们“纯生信是不是不好发文章了？还能不能做纯生信？”等问题，其实可以肯定地告诉大家，老套的纯生信思路确实不好发了，但是有些小伙伴确实实验条件有限不方便做细胞或动物实验，那针对这种情况该怎么办呢？怎么做才能又省钱又能发高分生信文章呢？简单点来说，新颖的数据分析 简单验证就是您的最优选择[赞]
其一就是提高分析思路的创新性（比如肿瘤代谢相关、新型细胞死亡、单细胞、蛋白组等）；其二是增加一些简单的队列验证，收集临床样本做些qPCR、WB、免疫组化等，既能验证分析结果又扩充了数据量还增加了真实世界研究提高了临床意义，三效合一，何乐不为呢？如果能两种都做到，强强联合的话，高分文章岂不就分分钟收入囊中啦！
思 路 设 计
今天小编就带来了1个7分 强强联合的思路（2022年3月发表于Frontiers in Immunology，IF=7.561），肿瘤代谢相关风险预测模型构建 简单队列验证，思路创新性高还极易复现，你还在等什么？学起来就完事了~ ~ ~
研究背景
前列腺癌（PCa）是男性最常见的恶性肿瘤。尽管近几十年来PCa的临床治疗取得了很大进展，但一旦出现对治疗的耐受性，复发后疾病进展迅速。PCa 表现出独特的代谢重编程，并且此变化从最初的瘤形成一直持续到晚期PCa。作者的前期研究表明，雄激素受体（AR）信号通路的激活与PCa细胞内脂质蓄积之间存在相互促进作用，从而推动了去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的进展，而脂质的异常蓄积与二代抗雄激素耐药密切相关。然而，大多数研究只关注某些基因变化对 PCa 中肿瘤细胞或某些 TME 细胞代谢的影响。因此，系统全面地探索肿瘤代谢格局，将加速PCa代谢领域的发展，更有利于为PCa患者提供准确的临床预后信息和指导治疗。
数据来源
- TCGA数据库：PCa RNA-seq 数据集，作为训练集
- ICGC和 Taylor数据库：PCa 数据集，作为验证集
- 分子特征数据库MSigDB：获得代谢相关基因（MRG）
- 真实世界研究队列：59 个正常前列腺组织和196个PCa 组织，作为验证队列（简单实验验证）
主要结果
1. 前列腺癌代谢相关差异表达基因的鉴定与分析
作者首先从TCGA PCa数据集中筛选并获得了1186个与代谢相关的差异表达基因 (mDEG)（图1A）。GO和KEGG富集分析发现mDEG多富集于脂质代谢、氨基酸代谢、激素代谢和羧酸生物合成等生物过程，并且与药物、花生四烯酸、酪氨酸和嘌呤代谢途径显着相关（图1B，C）。针对mDEG共识聚类分析发现，患者可分为三个亚组（图1D，E），三个亚组的DFS的KM分析存在显着差异（图 1F）。总的来说，这些结果表明肿瘤代谢重编程在 PCa 复发和进展中起重要作用。
2. 筛查前列腺癌生存相关关键mDEG
作者通过STRING 数据库构建PPI网络识别hub基因，根据连接得分得到前100个hub 基因并进行GO和KEGG富集分析（图2A）。KEGG分析结果显示，关键mDEGs富集于突触通路、能量代谢通路、药物代谢通路、胆固醇代谢通路等，前 10 个富集的 GO 术语包括类固醇和激素代谢过程、内质网腔、GTPase 复合物和代谢物条带（图2B，C），表明关键 mDEG 在代谢和 PCa 进展中的重要作用。然后使用单变量 Cox 回归分析，根据前 100 个hub基因筛选获得了25个与 DFS 相关的 mDEG，包括10个危险因素和15个保护因素，大多数与生存相关的关键 mDEG 彼此相关（图2D，E），这表明 PCa 中的代谢重排是整体变化而不是单个基因变化。
3. 构建代谢相关风险模型以预测前列腺癌患者的无病生存期
为了建立一个全面有效的预后代谢相关风险模型（MRM），作者对 DFS 相关的关键 mDEG 进行了 LASSO Cox 回归分析，交叉验证后获5个基因APOE、AHSG、BGN、SLC2A4 和 CYP2D6（图3A，B）。随后进行了多变量Cox回归分析，进一步证明了独立的预后相关基因并获得了基因指数，APOE、AHSG、BGN、CYP2D6为独立危险因素，SLC2A4为独立保护因素。基于以下公式构建用于预后的MRM：代谢相关风险评分（MRS）= 0.19 * the expression of APOE 0.17 * the expression of AHSG 0.25 * the expression of BGN 0.36 * the expression of CYP2D6 − 0.27 * the expression of SLC2A4.（图3C）。根据该模型计算 MRS，并根据 MRS 中位数将 492 名 PCa 患者分为高 MRS 亚组（n = 246）和低 MRS 亚组（n = 246）（图3D）。高 MRS 亚组的 DFS 率明显低于低 MRS 亚组，表明 MRS 越高表明复发概率越高。ROC曲线表明 MRM 可作为预后临床特征且具有良好的敏感性和特异性（图E-G）。此外，ROC 曲线表明 MRM 的预测 DFS 准确性优于其他临床参数（Gleason 评分、前列腺特异性抗原（PSA）水平以及 TNM 分期和年龄）。作者还探讨了 MRS与临床特征和关键 mDEG 表达水平之间的关系，发现 APOE、BGN、AHSG 和 CYP2D6 的表达在高 MRS 亚组中增加，而 SLC2A4 的表达则相反，MRS 与 Gleason 评分、T 分期、N 分期和 M 分期呈正相关，但与 PSA 水平无关（图3H，I）。单变量 Cox 回归表明 Gleason 评分、PAS 水平、T 分期和 MRS 与 PCa 的 DFS 密切相关。图 3J)，多变量 Cox 回归发现 MRS 的 p 值 (p < 0.001) 低于其他临床特征，这表明 MRS 可能是 PCa 最重要的独立预后指标。
4. 在两个独立的PCa队列和真实世界研究中验证MRM的预后价值
为了验证模型的预后价值，作者利用Taylor 和ICGC中的PCa 队列计算MRS，发现验证队列与 TCGA 数据库的结果相似，MRS 较高的患者 DFS 时间或 BCR 时间较短，复发的可能性较大，预后较差（图4A）。ROC曲线表明 MRM 可能是预测 PCa 患者 DFS 的潜在临床特征，具有较高的准确性和可靠性，且MRM 的预测准确性优于其他临床特征（图4B，C）。在 Taylor 中，单变量和多变量 Cox 回归分析均显示 Gleason 评分、PAS 水平、T 分期和 MRS 与 DFS 密切相关，可以作为 PCa 的独立预后指标（图 4D）。在 ICGC PCa 队列中，单因素 Cox 回归分析显示 Gleason 评分、T 分期和 MRS 与 DFS 密切相关；多因素 Cox 回归分析发现，只有 T 分期和 MRS 是 PCa 的独立预后指标，而 Gleason 评分不是 PCa 的独立预后指标（图 4E）。这些数据表明 MRM 是两个独立 PCa 队列中 DFS 或 BCR 的最佳独立预测因子。
接下来作者利用收集的临床组织调查了 MRM 在真实世界中的预测价值，通过qRT-PCR 以评估 DFS 相关关键 mDEG（APOE、AHSG、BGN、SLC2A4 和 CYP2D6）在PCa 组织和匹配的正常前列腺组织中的表达并基于基因的相对表达计算组织的MRS。利用IHC测定组织中DFS 相关关键 mDEG的蛋白表达，并根据其免疫反应评分 (IRS) 获得蛋白质水平的MRS（pMRS）。结果显示，与正常前列腺组织相比，AHSG、APOE、BGN 和 CYP2D6 在 PCa 组织中显着上调，而 SLC2A4 显示相反的结果。进一步分析发现，MRS和pMRS与Gleason评分和T分期密切相关，pMRS与N分期和分级呈正相关（图4F，G）。
5. MRS的分子功能和机制
作者首先进行基因集富集分析 (GSEA) 以预测 PCa TCGA 队列中高 MRS 组和低 MRS 组之间的基因集变化。结果表明，高 MRS 样本的基因组聚集在与增殖和细胞周期相关的途径中，而低 MRS 样本的基因组富集在 PCa 中下调和在转移性肿瘤中下调的基因中（图 5A），表明 MRM 亚组之间的肿瘤生长和转移存在显着差异。随后作者进行了基因表达分析，通过比较高和低 MRS 组鉴定了 1,258 个基因（图 5B）。进一步的研究发现，DEGs大多富集于多种代谢过程、跨膜转运蛋白复合物和酶活性（图 5C）。KEGG分析还表明，这些DEGs与代谢途径密切相关，如PPAR信号通路、cAMP信号通路、类固醇激素生物合成、胆固醇代谢和药物代谢（图 5D，E），并且各亚组具有不同的代谢特征。
6. 不同MRS亚组的免疫特征
作者探讨了 MRS 和 TME 之间的关系，发现MRS 与 TME 评分呈正相关，高 MRS 组的免疫细胞浸润和基质评分高于低 MRS 组，高 MRS 样本的基因组富含免疫反应相关通路（图6A，B）。随后又利用六种独立算法（CIBERSORT、xCell、quantTIseq、MCP-counter、EPIC 和 ImmuCellAI）计算了来自 TCGA 数据库的 PCa 样本中免疫细胞的比例以评估MRS 与 PCa 中免疫细胞浸润之间的相关性，结果显示在高 MRS 亚组中 B 细胞、CD4 T 细胞、巨噬细胞、树突细胞和 CAFs 的浸润更丰富，而在低 MRS 亚组中，CD8 T细胞和中性粒细胞更丰富（图6C）。作者筛选并收集了经典的免疫检查点，并应用这些基因来定义不同 MRS 组之间的免疫和分子功能，发现 MRS 与 30 个免疫检查点的表达密切相关，包括 PDCD1、PDL1 和 CTLA4。值得注意的是，高 MRS 样本中 CTLA4 和 PDCD1 的表达显着升高（图 6D，E)，这表明免疫疗法可能是对这些患者相对有效的治疗方法。同时， MRM 的 AUC 值在预测对免疫治疗反应的临床特征中最高（图 6E），表明MRM 可能是预测 PCa 患者免疫治疗反应的潜在指标。最后，作者利用临床组织石蜡切片进行了多重免疫荧光 (mIF) 以检测关键 MRG 和经典免疫检查点的表达并分析它们的相关性，发现高 MRS 亚组中 CTLA4 和 PDCD1 的表达均高于低 MRS 亚组（图6F）。综上，这些结果表明高 MRS 亚组比低 MRS 亚组更有可能从免疫治疗中受益。
7. 不同MRS亚组的前列腺癌患者对药物的敏感性
鉴于 GO 和 KEGG 分析表明 MRS 参与药物代谢、激素合成和代谢相关途径，而抗雄激素治疗和化疗是晚期 PCa 的主要治疗方法，作者假设不同 MRS 亚组的患者对药物有不同的敏感性。首先分析了药物代谢相关的途径，发现与内分泌治疗耐药、DNA 修复基因、甲基化沉默和阿霉素耐药相关的通路与高 MRS 相关，而与药物反应相关的基因与低 MRS 呈正相关（图7A）。随后作者比较了高 MRS 组和低 MRS 组对常见抗癌药物的敏感性，以指导不同 PCa 患者的治疗选择。在标准药物选择方面，低 MRS 亚组患者对抗雄激素（阿比特龙）更敏感，而高 MRS 组患者对化疗（多西他赛和吉西他滨-顺铂（GC）化疗）更敏感（图 7B）。在推荐药物选择方面，低 MRS 亚组患者对 EGFR 抑制剂（如阿法替尼）、BI-2536（PLK1 和 BRD4）、HDAC 抑制剂（他西地那林）和 TGF-β 受体抑制剂（SB- 505124），而高 MRS 亚组的患者对 CDK 抑制剂（例如 AZD 5438）、PARP 抑制剂（例如 niraparib）和铁死亡激动剂（RSL3，erastin）更敏感（图 7C、D）。
文章小结
本研究确定了关键的 mDEG，呈现了代谢景观，并构建了一个在预测 PCa 患者的 DFS 以及预测对治疗的反应方面表现出高诊断准确性的 MEM。文章的亮点在于不同于以往研究只关注某些基因变化对 PCa 中肿瘤细胞或某些 TME 细胞代谢的影响，而是系统全面地探索了肿瘤代谢格局。整体分析思路较为新颖，搭上了“肿瘤代谢”的国自然热点，并且利用公共数据和真实世界研究数据进行模型验证，妥妥的高分生信 验证模板文章呀，小伙伴们赶快操练起来吧[得意]
