Todorov LG, Sivaguru M, Krambeck AE, Lee MS, Lieske JC, Fouke BW. GeoBioMed perspectives on kidney stone recurrence from the reactive surface area of SWL-derived particles. Sci Rep. 2022 Nov 1;12(1):18371. doi: 10.1038/s41598-022-23331-5. PMID: 36319741; PMCID: PMC9626463.
冲击波碎石术（SWL）是一种有效且普遍应用的人类肾结石临床治疗方法。然而，SWL 的成功被滞留碎片导致复发性结石形成的风险所抵消，这可能需要重新治疗。本研究应用GeoBioMed实验和分析方法，通过共聚焦自发荧光（CAF）和超分辨率自发荧光（SRAF）显微镜揭示了SWL衍生颗粒在其原始晶体生长结构（晶体结构）的背景下的尺寸频率分布，断裂模式和反应表面积。使用标准经皮肾镜取石术 （PCNL） 和冲击脉冲碎石术 （SPL） 从妙佑医疗国际的一名患者中取出了多个草酸钙 （CaOx） 结石。这产生了大约4-12毫米直径的PCNL衍生片段，这些片段用SWL进行体外实验处理以形成数百个较小的颗粒。裂缝通过 PCNL 衍生碎片的晶体结构以各种几何方向传播，形成矩形、尖头、同心剥落和不规则 SWL 衍生颗粒。根据温特沃斯粒度尺度，粒度频率分布范围从细粉砂（4-8μm）到非常细的鹅卵石（2-4毫米），细砂的平均尺寸（125-250微米）。重要的是，这些SWL衍生的颗粒小于临床计算机断层扫描（CT）技术的3-4毫米直径检测限，并且可以保留在肾膜内表面。这会产生临床上无法检测到的结晶种子点，具有极高的反应表面积，这显着增强了结晶和溶解的多种事件（成岩相变），这可能导致SWL治疗后CaOx肾结石的高复发率。
肾结石的全球患病率和发病率持续增加，从关注有限的无症状偶然发现到疼痛的复发性疾病，甚至慢性肾脏疾病1.这在所有性别、年龄、民族和种族队列中都观察到，同时表现出很大的地理差异，从美国的 3% 到 15% 到亚洲的 1-19%、南美洲的 4%、欧洲的 5-10% 和中东的 20-25% 不等。1–14.全球肾结石发病率增加的很大一部分是由于使用非增强计算机断层扫描（NCCT）改进的医学成像15–20.此外，由于诊断代码、自我报告、结石术语和分类、危险因素识别以及与预测和监测结石复发相关的其他不确定性，肾结石疾病的准确诊断进一步复杂化1.因此，症状性肾结石的明确诊断仍然从根本上取决于实际结石的成像、手术切除时或排空后的观察1.
由于这些复杂的交织因素，冲击波碎石术（SWL）仍然是全球肾结石的常见非侵入性临床干预措施，因为它的成本相对较低，在破碎和至少部分消除直径小于约60-11毫米的结石方面的有效性约为20%9,16,21–24.尽管临床 CT 技术目前接近 1 mm 分辨率，但直径≤ 3-4 mm 的 SWL 衍生残留结石颗粒的患者被认为是“临床上不显着的残留碎片”，因为它们被认为能够自发通过。因此，碎片达到这种大小的患者被归类为“无结石状态”，被认为不需要进一步治疗15–18,25.相比之下，SWL治疗后的患者通常也会经历高达~78%的高结石复发率26,27，这可能至少部分是由于在肾脏组织学切片中观察到的 SWL 诱导的组织损伤部位的结晶引起的28.SWL治疗后的复发也被假定，但尚未通过实验证明，是由在整个肾脏解剖结构中发现的残留SWL衍生颗粒的晶体再生引起的。9,17,18,21,22,29–37.
本研究旨在从称为GeoBioMed的综合地质，生物学和医学方法的角度对SWL诱导的肾结石碎裂进行实验量化38–42.GeoBioMed与更好地了解SWL复发后直接相关，它结合了实践和理论地球科学方法，可表征晶粒尺寸并预测由此产生的化学反应性43–45.从接受标准经皮肾镜取石术（PCNL）联合冲击脉冲碎石术（SPL）的患者身上收集了6块草酸钙（CaOx）结石碎片（图）。1），通常用于直径大于约 11 mm 的宝石16.这些PCNL衍生的片段在Dornier Delta III碎石机上进一步离体分解，以产生各种较小的SWL衍生颗粒。确定SWL实验期间的重量损失（定义为[PCNL衍生的片段重量]−[总SWL衍生的颗粒重量]），并根据松散的SWL衍生颗粒的反射光图像测量尺寸频率分布®46,47.这些SWL衍生颗粒的一部分嵌入环氧树脂塞中，并使用以下方法分析抛光表面：（1）250 nm分辨率显微镜（反射光-RL;明场-BF;环形孔径对比度-RAC;相衬-PC;偏振-POL;透射光光电倍增管-T-PMT;共聚焦自发荧光-CAF）;（2）140纳米分辨率显微镜（T-PMT;超分辨率自动荧光-SRAF）。每个环氧树脂塞被制成25μm厚的双重抛光未覆盖薄片，用于140nm分辨率显微镜（BF，POL，RAC，T-PMT，CAF）。矿物学是通过这种高分辨率和超分辨率显微镜与拉曼光谱相结合来确定的。结果表明：（1）原有的晶体生长结构与地成后结晶和溶解改变（成岩相变）相结合，形成了CaOx肾结石的晶体结构;（2）这提供了一个重要的上下文框架，在其中识别和跟踪SWL断裂模式的发展方式42;（3）通过SWL处理产生当前临床CT和超声技术无法检测到的小颗粒（直径<3-4 mm），可以使用地质温特沃斯粒度尺度进行系统分类48.结果表明，这些小的SWL衍生颗粒产生的反应表面积急剧增加，这些颗粒分布在整个肾脏中，显着增强了成岩相变的多种事件，导致SWL治疗后结石复发率很高。
图1
实验研究流程图（见补充材料和方法中的解释）。首字母缩略词包括：SWL冲击波碎石术、PCNL经皮肾镜取石术、CT、计算机断层扫描、RL 反射光、BF明场、POL偏振、RAC环形孔径对比度、PC相衬、T-PMT透射光光电倍增管、CAF共聚焦自发荧光、SRAF超分辨率自发荧光和 ×10、×20、×63显微镜物镜放大倍率。
转到：
结果和讨论PCNL衍生片段的晶体结构
本研究中进行的高分辨率和超分辨率光学、激光、X射线显微镜和拉曼光谱表明，原始PCNL衍生的片段具有与先前在CaOx肾结石中观察到的一致的晶体结构38–42.按照这些先前研究中提出的方法，术语“晶体结构”在这里用于指石结构（晶体尺寸，形状，相互生长的形态），地层学（晶体和有机物分层），成岩相变（沉积后溶解和重结晶）和副发生（形成事件的历史序列）。因此，地球生物医学的方法和术语38–42已在本研究中直接采用和应用。RL显微镜和X射线计算机断层扫描（CT）表明，原始PCNL衍生的碎片是不规则的4-12 mm直径结晶聚集体，表现出SPL探针印模和断裂模式（图）。（图2A，B，2A，B，SFigs。1,2).本研究中每个PCNL衍生和SPL衍生的片段主要是高密度草酸钙一水合物（COM;惠韦尔石;爸爸2O4·H2O） 皮层 （COMC）由富含有机物的纳米层（肽、蛋白质和其他细胞分子）和富含COM矿物质的纳米层的高频交替组成（图）。2B–F）49–52.所有六个PCNL衍生的碎片都受到使用SPL探头产生的超声波能量和间歇冲击波的不同程度的影响。这包括一些PCNL衍生碎片外部的破损表面和缺口形成（图）。2A，B，SFigs。1,2），以及 COM 中罕见的细压裂C仅在 SPL 凹口附近观察到（图3A).
图2
肾结石碎片3F106的三维（3D）外部形态和薄片2F106-3和1F106-3的二维（2D）内部晶体结构。（A） 整个宝石的 3D 反射光 （RL） 图像，显示 PCNL SPL 过程中产生的凹口（白色箭头）。补充表中的重量数据S1.插图是从不同方向对整个石材进行 3D 计算机断层扫描 （CT） 外表面渲染，显示了剖面线（白线）。制备薄切片106F3-2~500μm以下的切片。（B） 在 （A） 插图中剖面显示的 2F106-3 的二维虚拟薄切片 1F<>-<> 的明场 （BF） 图像，展示了最早到最晚的石材生长结晶的完整历史。红色框表示图中显示的放大位置。3.插图是通过 （A） 所示截面线拍摄的 2D 虚拟 CT 横截面。白色箭头表示对应于 （A） 的 PCNL 和 SPL 凹口，红色框表示 （B） 中的放大。（C）（B）的偏振（POL）图像。红色框表示图中显示的放大位置。3.（D）合并的假彩色红色，绿色和蓝色（RGB）通道的平铺共聚焦自发荧光（CAF）图像表明COM皮层（COMC）由纳米层组成。红色框表示图中显示的放大位置。3.（E）薄截面106F3-2的T-PMT，表现出PCNL衍生的106F3石头碎片的原始内部晶体结构。（F） （E） 合并的伪彩色 RGB 通道的平铺 CAF 图像。
图3
草酸钙（CaOx）PCNL衍生片段的原始晶体结构。（公元、卒、戊）SRAF 图像。（B，C，F，G，H）CAF 图像。标签指示：FR断裂，FA断层L板条，SZ扇区，COMFF自由浮动的 COM，COMCCOM cortex，COMB从 COM 辐射的 COM 束FF、COMM模拟替换 COM，COMR替换通信，CODD溶解的COD;和E，红色AF嵌入环氧树脂。图中显示的图像位置。2B-D 和和 4C4C和相应的T-PMT图像如补充图所示。S3.
COM 中的单个晶面（扇区）C是常见的，并且由于不平衡沉淀而形成，在此期间离子和有机物差异地掺入年龄等效的晶体生长面上（图）。3B，C，H）38–42,53.自由浮动的COM晶体（COMFF） 被单独或成簇埋葬在不断增长的 COM 上C同心表面播种辐射晶体束（COMB），截断或重定向扇区的增长（图。3C，F）。此外，COMC通常表现出晶体破裂（开裂）和断层（跨裂缝的位移）的体内重复事件，以形成具有不连续分层的板条（图）。3D，E）。.COMC还表现出 Ångstrom 级溶解和重结晶（模拟置换，COMM） （图.3E，G）。PCNL衍生片段的最外层边缘由草酸钙二水合物（COD;韦德利特;爸爸2O4·2H2O） 被COM包裹的晶体C，经验丰富的COD溶解（CODD），并部分填充了替换 COM （COMR） （图.3H).
SWL 衍生颗粒的断裂几何形状
通过CAF和SRAF显微镜揭示的SWL衍生颗粒的晶体结构提供了一个高保真晶体框架，在该框架中表征SWL诱导的断裂几何形状（图）。（图5，5,,6).6).重要的是，先前使用扫描电子显微镜（SEM）对SWL衍生颗粒的研究为外部和内部CaOx晶体生长和压裂形态提供了有价值的信息。49.然而，与CAF和SRAF显微镜提供的晶体结构详细信息相比，SEM工具本质上是有限的。38–42.在本研究中观察到SWL诱导的断裂相对于原始PCNL衍生碎片的纳米层状晶体结构在各种垂直，倾斜和同心平行轨迹中传播（图。（图5，5,,6;6;SFigs。6–10).这些观察结果已被整合起来，为SWL衍生的颗粒建立了断裂形态的系统命名法，其中包括：（1）矩形颗粒，其裂缝边缘垂直于COM形成C同心纳米层地层（图）5A），平行于辐射扇区（图）。6B，D）和横切COM模拟替换（COMM）晶体（图。6G)49,54–56;（2）由垂直、倾斜和平行于COM的裂缝形成的尖锐颗粒C同心纳米层地层（图）5B-H），它们以60°-120°的角度合并形成箭头状的尖端（图。（图5B-H，5B-H，6A，D）外观与硅酸盐和金属表面径向拉伸应力引起的赫兹锥壳状裂缝相似56–58;（3）沿同心有机物丰富的COM通过晶间和/或晶内压裂产生的同心剥落颗粒C通过粘性区脆性微裂缝剥裂的纳米层（图）5F，G）35,54,55;（4）由聚结微断裂产生的不规则表面颗粒，在施加循环拉伸应力时引起不可逆的疲劳损伤和很小的塑性变形54–56,59,60在最初从COM自由浮动（COMFF）晶体落地后生长的COMC表面（图。6B-H）。这些CAF和SRAF定义的断裂类别增强和改进了仅使用SEM的早期研究中完成的观察结果49.
图5
来自106F2-S1和106F4-S1组的SWL衍生粒子的几何形状（图）。4).这些详细的晶体生长结构和断裂模式，在薄片中观察到，类似于在抛光环氧树脂塞上观察到的那些（图。（图3，3,,6).6).嵌入环氧树脂发出的红色AF已从周围移除，但不在每个片段内，并替换为黑色背景。（A–H）合并的伪彩色RGB通道的CAF图像显示了横切原始CaOx晶体结构的SWL断裂几何形状。SWL冲击断裂相对于原始晶体结构以垂直和倾斜的角度传播，通常收敛形成60°–120°的角度（（B，C，D，F，H），白色箭头）。还观察到沿同心晶体分层剥落（（F，G），灰色箭头）。SWL衍生的颗粒位置如图所示。4和补充图。S5以及补充图中显示的相应BF和POL数字。S6和S7.
图6
嵌入环氧树脂塞中的 106F2-S1 和 106F4-S1 组的 SWL 衍生颗粒的晶体结构和断裂模式。（A–G）CAF 图像。（H） SRAF图像。标签指示：FR断裂、FM断裂边缘、FA断层L板条、SZ扇区、COMFF自由浮动的 COM，COMCCOM cortex，COMB从 COM 辐射的 COM 束FF，MF微裂缝，COMM，模拟替换COM;和E，红色AF嵌入环氧树脂。图像位置如图所示。4 以及相应的T-PMT图，见补充图。S8.
SWL衍生的粒径分布
在72小时的过程中2o 原始PCNL衍生片段的孔隙率饱和度61，106F2 和 106F4 的重量都增加了约 10%（图7A）. 较大的PCNL衍生片段106F2暴露于六次连续离体100休克SWL处理，以每分钟3次电击的速度具有一致的90级强度（图）。7).较小的PCNL衍生片段106F4仅以相同的冲击波强度和速率进行两次100冲击处理（图）。7).将每个100次冲击处理产生的SWL衍生颗粒用2 mm目网在碎石机的校准容器中过筛，称重并成像（SFig.3稳定1).观察到在2 mm目网中捕获的SWL衍生颗粒的重量百分比在第一次50次冲击处理后从约85-100%下降，最终在渐进式处理后达到0%的下降。这与之前对冲击波治疗增加体重减轻的观察结果一致50.将小到足以通过 2 mm-mesh 网的 SWL 衍生颗粒级分捕获在 0.47 μm 过滤器上，成像、定量并根据温特沃斯粒度尺度进行分类（图）。7B，C）48,62,63.这些分析表明，通过106毫米网的2F106和4F2衍生的SWL颗粒的尺寸范围从非常细的淤泥（4.998 μm）到非常细的鹅卵石（2.926毫米）（图）。7B，C，可控2).来自106F2和106F4的SWL衍生颗粒表现出右偏（正）正态尺寸频率分布（在Garcia，2008之后），细砂的尺寸等级模式（图）。7B，C）64.尽管使用了4.0 μm过滤器，但本研究并未检测到小粘土尺寸（<直径为47μm）的SWL衍生颗粒（图）。7），在SWL实验的连续阶段之间倾析时，可能会丢失一些未知量的细粒度等级。
图7
SWL衍生粒子群106F2和106F4的重量变化和尺寸频率分布。（A）PCNL衍生片段106F2和106F4在H72小时后的重量变化2O SWL 实验前的饱和度，以及每次增量 100 冲击处理期间 SWL 衍生颗粒实验期间的重量变化。相应的RL图像和数据在补充SFig中提供。4和补充 STable1.（B）六次106冲击处理后SWL衍生颗粒的温特沃斯晶粒尺寸频率分布。（C）两次2冲击处理后100F106的SWL衍生颗粒的温特沃斯晶粒尺寸频率分布。补充 STable 中提供的相应数据2.
影响
本研究中的实验结果表明，CaOx PCNL 衍生片段的每次 SWL 处理产生直径为 5 μm 至 2 mm 的 SWL 衍生颗粒，其范围在温特沃斯粒度尺度上，从非常细的淤泥到沙子和非常细的鹅卵石（模式 = 125-250 μm 直径的细砂;无花果。7).这些SWL衍生颗粒中的大多数明显低于临床非增强计算机断层扫描的3-4 mm直径检测限20,65,66.正如这里所讨论的，本研究的结果以及先前研究的推断表明，这些小的SWL衍生颗粒可能会增加SWL治疗后结石复发的机会。67–70.因此，常见的临床实践是使用阴性计算机断层扫描屏幕来识别和宣布患者“无肾结石”，并具有“临床上不显着的残留碎片”17,18,24,29,69,71–76，应该从根本上重新评估。
在自然环境水域中，控制矿物沉淀和溶解反应速率和程度的主要因素包括矿物稳定性、流体饱和状态和每单位质量矿物颗粒的可用表面积43–45,77.此外，精细晶体结构（晶体结构）和晶体聚集体晶粒尺寸在初级（原始）结晶和次级物理、化学和生物改变（成岩作用)42,78,79肾结石沉积物。随着晶粒尺寸和体积的减小，每克总表面积的增加可以近似为（沃尔特和莫尔斯）45:
一个=λρ∗V=(βρ)r−1,
1
其中 A = 比表面积 （SSAp）每单位质量（g）的每个颗粒，λ= 颗粒表面积（也称为 Ap） 每单位质量 （g），使用从晶粒尺寸得出的球面半径 （r） 近似为球体：Ap = 4 πr2，V = 每个粒子的体积（也称为 Vp） 作为等效球面半径 （r） 的函数：Vp = 43 πr3,ρ= 材料的堆积密度 （COM）80= 2.12 克/厘米3,β= 球体或立方体的形状因子，基于表面体积比为 3，并假设几何等维粒子。
这些估计允许SWL衍生颗粒的尺寸频率分布，如本研究中测量的那样（图）。7），用于定量估计有效反应表面积对SWL复发后的影响（图）。8).这个简单的近似值戏剧性地表明，SWL衍生粒径的减小伴随着总表面积的指数增长，可用于随后的晶体生长和/或溶解的连续事件（成岩相变)42,78,79（图）8).先前对细晶海洋碳酸盐骨架成分（珊瑚、棘皮和藻类骨架）的实验研究表明，纹理微观结构（在本研究中称为晶体结构38,42）、表面粗糙度和晶粒尺寸共同影响总反应表面积45,81.然而，在本研究中观察到的CaOx肾结石颗粒的致密相对无孔的内部晶体结构（图。（图2，2,,3,3,,4,4,,5,5,,6)6）表明总外表面积是PCNL衍生片段和SWL衍生颗粒中反应表面积的合理一阶近似（图）。8).
图4
PCNL衍生的片段106F2（A）和106F4（D）经过SWL产生粒子群106F2-S1（B，C）和106F4-S1（E，F）。来自前100次SWL冲击的颗粒被成像（B，E）并嵌入环氧树脂塞（C，F）中。（公元，卒）在SWL处理之前悬浮在2毫米网篮内的PCNL衍生片段的RL图像。实验过程中的 3D 外部晶体形态、2D 内部晶体结构和 RL 图像的相应图显示在补充图中。S2和S4.（乙，东）松散的SWL衍生颗粒的RL图像，这些颗粒经过手工追踪和人工着色的粉红色，用于精确的像素选择和粒度量化。（中，女）在薄片制备之前嵌入环氧树脂并抛光的SWL衍生颗粒的RF图像（红色框表示图中显示的放大位置。3,,5,5,,6,6，补充图S9).
图8
比表面积对数图（m2/g）作为晶粒直径（微米）的函数，遵循温特沃斯晶粒尺寸分类方案。表面积计算（在文本中详细描述）是根据实验测量的SWL衍生颗粒的尺寸频率分布进行的（图）。7;红色水平线）并假设几何等维粒子。还显示了临床CT筛查的3-4 mm直径检测限（蓝线）和示例250 nm分辨率CAF显微镜图像。非对比度计算机断层扫描图像的 3 mm 分辨率排除了高频晶体结构和整体 SWL 衍生的颗粒断裂几何形状。在补充 STable 中找到的相应数据3.
这些评估允许在表面和运输控制化学反应性制度的背景下评估SWL衍生的粒径和相关表面积的影响43,44.结果，SWL衍生的颗粒低于临床非对比计算机断层扫描扫描仪检测的尺寸限制（图）。8）仍然具有极高的潜力作为晶体生长和结石复发的病灶82.此外，这些细小的SWL衍生颗粒（图。（图7，7,,8)8）对肾组织（如糖胺聚糖透明质酸）上的细胞外粘液衬里的粘附具有高亲和力83.这将有助于降低SWL后灌溉的有效性18，以及减少不同漏斗骨盆角下的自发通过16.这也进一步支持了Brain等人的建议，即在评估患者结石复发风险时，不应忽视较小的SWL衍生粒径部分。24.因此，如前所述，应避免使用诸如“临床上不重要的片段”之类的术语。
本研究的结果对冲击波碎石术的所有应用具有重要意义，冲击波碎石术自 1980 年代以来一直在临床上使用，并激发了广泛的对照实验，以更好地了解碎裂机制、提高治疗效率并减少 SWL 结石复发后84.这项工作的大部分是在悬浮在水中的人造复合材料（begostones或幻影石）上完成的63,85–92.此外，其他研究表明，COM比COD更能抵抗SWL生成的碎片。50.然而，之前的工作使用了“物理性质”，没有考虑原始CaOx肾结石晶体结构，尺寸频率分布（与基于晶粒平均值的声学粉碎相反），断裂几何形状以及反应表面积对复发的影响。
关于断裂模式，在本研究中接受离体SWL处理的每个PCNL衍生片段的原始CAF和SRAF定义的晶体结构创建了一个几何框架，在该框架中可以识别SWL诱导的断裂传播模式。这些晶体织物的范围从数百个微米直径的大单晶到数十纳米直径的纳米晶体，形成同心纳米层93.此外，这些SWL衍生的颗粒表现出矩形，尖头，同心剥落和不规则的颗粒几何形状。类似于由燧石（燧石)94，这些不规则碎片具有锋利的边缘，可以刺穿、落在、切入和损伤整个肾脏、膀胱和尿道的敏感组织，这可能进一步导致随后的结石复发28,42.
总之，SWL衍生的粒径频率分布、断裂模式和反应表面积的影响现在为许多新的实验研究方向开辟了道路，以开发旨在减少SWL后肾结石复发的疗法。例如，影响每个温特沃斯尺寸类别的SWL衍生颗粒的成岩相变和反应表面积的因素现在可以在微流体测试台（如GeoBioCell）中使用尿 - 结石 - 微生物 - 肾组织相互作用的受控实验进行测试38–42,79.特别实用的是SWL衍生颗粒的小尺寸，很容易放入GeoBioCell微流体流动室和通道中，因此可以实时定量跟踪由各种相互作用的物理，化学和生物过程控制的成岩相变41,93,95.可能的例子包括39,42：（1）实时系统分析促进和抑制大分子（即阴离子蛋白和糖胺聚糖）催化微生物组和宿主人源性蛋白质对晶体聚集和细胞附着的影响10,11,31,42,51,96;（2）控制晶体生长形态、矿物学、化学、聚集、分层、溶解和再结晶;（3）埋藏在CaOx肾结石中的特定细菌和真菌排泄的柠檬酸、草酸和甲酸等有机酸对结石溶解的影响。此外，新的GeoBioCell微流控测试台本身可以通过3D腔室打印，二氧化硅蚀刻和肾细胞3D打印的多种配置来设计和构建微流体流道，以模拟实际的肾脏水文学，解剖学和生理学。41,42.此外，现在可以系统地测试特定植物提取物和抗氧化剂（如羟基柠檬酸盐）对SWL后成岩相变、细胞控制、尿液过饱和度和流速的影响，以及它们对CaOx肾结石复发的影响82,97–101.
转到：
材料和方法所有临床方案均已获得妙佑医疗国际机构审查委员会的批准。本文总结了本研究中应用的实验设计和方法，并在补充材料中进行了详细描述。这包括本研究中完成的系统分析的流程图（图）。1).使用标准PCNL和SPL从一名患者中收集肾结石碎片。从患者106的病历中评估病史，标准血清实验室，药物摄入量（例如柠檬酸盐，噻嗪类，别嘌呤醇）和合并症（例如糖尿病，肥胖，痛风，高血压，远端出租性肾小管酸中毒，吸收不良相关病症和疾病）。术前数据包括患者年龄、性别、BMI、既往手术史、既往代谢结石治疗、基于 CT 扫描的结石位置和结石密度测量。代谢检查，包括24小时尿液收集和EQUIL2计算的过饱和度，在PCNL干预前后一个月完成，两年后完成一次（STab 4-5）。收集六个~4-12毫米直径的PCNL衍生片段（标记为106F1-6）并在去离子水中洗涤，风干并成像（SFig。1A）. 在妙佑医疗国际金属实验室 （SFig.1伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校（伊利诺伊州）的高分辨率和超分辨率显微镜和共聚焦拉曼光谱分析证实了这一点，此外还发现了微量的草酸钙二水合物（COD）。这些PCNL衍生的片段立即被放置在-80°C的干托运杜瓦瓶中，并运送到伊利诺伊州的Carl R. Woese基因组生物学研究所（IGB）。在分析时，将样品在室温下解冻24小时。
分析了来自单个患者的六个PCNL来源的结石碎片，其中四个被选中用于本研究（图）。1).蔡司 AxioZoom.V3 上的三维 （16D） 反射光成像和北极星成像 X3 上 5000 μm 分辨率的 CT 扫描在伊利诺伊州 IGB 的 IGB 中的 106F1-4 上完成。随后使用CT数据选择截面线，并从PCNL衍生的片段106F3中战略性地定向，切割和生产双重抛光的薄切片，该切片显示出最早到最晚晶体生长的完整横截面。PCNL衍生的片段106F3是三维取向的，用环氧树脂浸渍，并由L. Todorov在Buehler（伊利诺伊州芝加哥）制成~60μm厚，双重抛光，未覆盖的薄切片（106F3-1）。从薄片（106F3-2）上切割的剩余环氧树脂嵌入样品，在蔡司Axio Zoom.V16上成像，并送到瓦格纳岩相学制备成标准尺寸（24毫米×46毫米），未覆盖（无盖玻片），双重抛光薄片（~25μm）。在从瓦格纳岩相公司收到 106F3-1 和 106F3-2 薄片后，在 Carl R. Woese 基因组生物学研究所的显微镜和成像核心设施中使用蔡司 Axio Zoom.V106、AxioScan.Z3、Axio Observer 和 LSM 1 共聚焦系统对 16F1-880 进行了显微镜分析。
PCNL衍生片段106F1用于实验标准化，PCNL衍生片段106F2和106F4用于SWL研究使用Dornier Delta III碎石机。在制备SWL时，将两个PCNL衍生片段（106F2，106F4）用72小时脱气的18.2 MilliQ H饱和®2O 在真空室内24小时61.将碎石机设置为90次冲击/分钟，每次处理以100次冲击为增量，耦合压力为4，功率水平为3。将样品放置在连接到SWL仪器的校准室中。这种配置模拟冲击波穿透人体组织，并在包含样品的2毫米网的中心聚焦冲击波。每100次电击处理后，分别收集2毫米网内筛分的SWL衍生颗粒和落入2毫米网的SWL衍生颗粒并拍照。在真空系统中使用0.47μm混合纤维素酯膜滤纸提取和使用2.2μm混合纤维素酯膜滤纸提取和过滤含有落下的SWL衍生颗粒的水浴。去除<>毫米网内的SWL衍生颗粒，称重，然后返回进行后续处理。重复该过程，直到<>毫米网状网中的所有碎片完全破碎。确定SWL研究期间的重量损失（[PCNL衍生的片段重量]−[总SWL衍生的颗粒重量]），并根据松散的SWL衍生颗粒的反射光图像测量尺寸频率分布。
在每次106次冲击处理后，从校准容器水浴中收集来自2F106和4F100的SWL衍生颗粒，放入称重舟中，并在蔡司Axio Zoom.V16显微镜上成像。使用Adobe Photoshop和RGB伪彩色（红色= 210，绿色= 0，蓝色= 255）完成图像分析，以确保准确的粒度量化（图）。4).然后使用蔡司AxioVision程序处理每个图像，将片段总数和测量直径转换为XML和XLSX文件。数据在Microsoft Excel上进行评估，并根据温特沃斯粒度刻度进行分箱。粒径频率分布只能从松散的SWL衍生颗粒中确定，因为由环氧SWL衍生颗粒制成的薄片由于抛光对截面平面高程的影响，可能会明显低于晶粒尺寸的样品。在第一次SWL 106冲击处理期间收集的来自2F106和4F100的SWL衍生颗粒被嵌入环氧树脂块中，在蔡司AxioZoom.V16，Axio Observer和LSM 880共聚焦显微镜上进行抛光和成像。然后将浸渍块运往瓦格纳岩相有限公司（犹他州林登）进行制备~25μm厚，未覆盖，双重抛光的薄片。接收到的106F2-S1和106F4-S1薄切片随后在蔡司AxioScan.Z1、带Airyscan超分辨率模块的LSM 880共聚焦显微镜和带有Airyscan超分辨率II显微镜的LSM 980显微镜上进行成像，以便进一步分析。
环氧树脂嵌入插头和薄片均在各种光学模态上成像。蔡司Axio Zoom.V16系统（Carl Zeiss，Oberkochen，德国），带有Plan-NeoFluar Z 1.0×物镜和Axiocam 512成像设备，用于反射和透射光显微镜，包括明场（BF）和偏振（POL）图像。使用蔡司AxioScan.Z1系统与Plan-Afuchromat（10×/0.45 NA）物镜和日立HV-F202SCL彩色相机来捕获BF，POL和环形孔径对比度（RAC）。蔡司 Axio Observer 系统与蔡司 Axiocam 506 彩色相机用于在广泛的放大倍率范围内捕获 BF、POL 和相衬 （PC） 图像。使用的物镜是Plan-消色差（10×/0.45NA）Ph1 M27 DICII、Plan-Aprochromat（20×/0.80 NA）Ph2 DICII和Plan-Aprochromat（63×/1.40 NA）油Ph3。对于POL图像，使用分析仪DIC透射光偏振器，角度设置为0°。使用蔡司LSM 880和蔡司LSM 980激光扫描显微镜对样品中观察到的共聚焦自发荧光（CAF）和Airyscan超分辨率自发荧光（SRAF）纳米层进行了研究和定量。合并的伪彩色 RGB 通道的平铺 CAF 图像展示了最早到最晚的宝石生长结晶的完整历史。除非图例中另有说明，否则所有图像均使用蔡司禅蓝和/或黑色软件进行处理，以显示最小和最大或最佳拟合属性。此外，红-绿-蓝（RGB）曲线被单独或一起调整，以突出整个样品中单个框架中的所有晶体强度。如果需要，在样条显示模式属性下，在同一Zen程序中应用0.45或0.70的非线性伽马校正以增强微弱的AF晶体强度，所有其他校正都显示在相应的图形图例中。最终图像使用Adobe Photoshop（Adobe Systems Inc.，加利福尼亚州圣何塞）进行裁剪，调整大小和组装，以适应所需的格式。
