基因检测中关于 “次要发现” 的ACMG建议 (2013→2022)（基因突变游戏）

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外显子组和基因组测序正在迅速整合到医学实践中。随着测序的价格不断下降，生物信息学技术的进步，为基因测序用于多种医疗场景创造了机会，如罕见病诊断、个体化治疗(尤其是癌症)、药物基因组学、孕前/产前筛查、疾病的风险人群筛查。在所有这些应用中，都有可能识别到偶然(或次要)发现，这些结果与当初的适应证无关，但可能对医师和患者具有医疗价值。

次要发现(secondary findings, SFs)是在WES/WGS检测过程中，发现一些与初始检测目的无关的其它致病或可能致病的基因变异，携带这些变异的个体将来极有可能罹患相应疾病。

2013年

2012年1月，美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)委员会正式成立临床外显子和基因组测序(Exome and genome sequencing)工作小组，此小组的任务就是当受试者进行外显子或基因组测序时发现SFs，给出推荐性的指导意见。

2013年，ACMG发表了一篇关于报告SFs推荐声明，明确强调了SFs可能对患者存在极为重要的价值。

Clinician 这一术语是指负责与患者及其家属直接接触的医生或临床团队。临床医师应接受遗传学和基因组学方面的培训，了解遗传咨询、家系分析和风险评估，以便为与临床基因测序相关的患者提供检测前和检测后咨询、护理、治疗等。

咨询过程中，需要告知接受/不接受基因检测的患者，在检测过程中存在发现SFs的可能性。
SFs的报告不因受试者年龄的限制。有人建议不要对儿童进行成人组疾病的预测性基因检测。但也有政策声明指出，“儿童的基因检测结果可能对父母和其他家庭成员有影响。”基因测序提供者有义务在适当时将这些潜在影响告知父母和儿童，因为在对儿童进行主要适应证的基因测序后，可能会发现一些对该儿童的未来或家庭其他成员具有医学价值的SFs。
以下列表中的基因变异(已知致病或预测可能致病)，无论基因测序的适应症是什么，实验室均应该报告。
56 个基因包括与遗传性乳腺癌和卵巢癌、肥厚型和扩张型心肌病、家族性高胆固醇血症等相关的基因
KP: known pathogenic, sequence variation is previously reported and is a recognized cause of the disorder;
EP: expected pathogenic,sequence variation is previously unreported and is of the type that is expected to cause the disorder.

2016年

ACMG SF v2.0

为了促进来自临床基因组测序的标准化报告，2013年，ACMG发布了作为次要发现报告的最少基因列表。旨在预防或显著降低相关疾病的发病率和死亡率，识别和干预高外显率的遗传性疾病。ACMG随后成立了次要发现工作组(Secondary Findings Working Group, SFWG)，制定了一套管理和随时间更新清单的流程。

2016年，在坚持原政策声明的核心原则的情况下，2.0版本的SFs基因列表增加了4个基因【与Wilson病相关的ATP7B基因，与幼年息肉病(juvenile polyposis)相关的BMPR1A和SMAD4基因，与鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症(ornithine transcarbamylase deficiency)相关的OTC基因】；去掉了1个基因【与家族性胸主动脉瘤和夹层(familial thoracic aortic aneurysm and dissection, FTAAD)相关的MYLK基因】。

MYLK基因变异是罕见的，且均为功能丧失(loss-of-function)的变异，目前也缺乏有效的验证性试验、筛查方式或干预措施来预防或降低FTAAD的发病率或死亡率，MYLK基因变异相关的主动脉夹层通常表现为无主动脉扩张史，超声心动图检查也无法干预，也不能预防心源性猝死。此外，关于药物治疗的适当年龄以及这种干预措施减少主动脉动态压力的有效性，目前还没有足够的证据。未来收集更多证据，可能会重新加入该基因。

更新后的列表有59个基因

2019年

2019年，ACMG发布了一项政策声明：次要发现在一般人群筛查中的应用。

ACMG SF v2.0基因列表未在一般人群筛查中得到验证。在无症状个体中会发现的许多ACMG SF v2.0列表中基因，而其外显率并不确定。该政策声明旨在减少仅基于基因型的未经证实的干预措施。在缺乏基因变异外显率数据的情况下，非伤害性的医学伦理原则应占主导地位。

在报告次要发现之外，ACMG强烈不鼓励引用ACMG SF v2.0 (或ACMG 59)这个术语。
此外，ACMG SF™、ACMG 59™、ACMG 56™以及包含ACMG™的相关词语和设计均为美国医学遗传学和基因组学学院的商标，未经许可不得使用。
ACMG鼓励大家研究基因型-表型的相关性，以便进一步确定在携带具有致病/可能致病变异(已知基因)的无症状患者中进行干预的有效性。

2021年

ACMG发布了一项声明：在生殖细胞系的遗传和基因组检测中关于获得性变异的次要发现。

在NGS质量指标中，如VAFs低于50%，特别是低于30%，可以提示体细胞变异的可能性。在这些情况下，如果样本中存在体细胞DNA变异，而分离出的DNA是来自生殖系细胞，则可能会误解孟德尔疾病的风险，而实际结果是由获得性体细胞变异造成的。

克隆性造血中最常见的突变基因

会增加CHIP人群的相关疾病风险

变异等位基因频率(variant allele frequency, VAF)/Variant Allele Fraction(变异等位基因分数)是在基因组某个位点的alternate/mutant allele的reads覆盖深度占这个位点总reads覆盖深度的比例。VAF用得比较多的地方是在二倍体germline的genotyping中，杂合位点的VAF在高深度(比如depth>80)情况下应该接近50%；如果VAF接近0.25/0.75说明基因组上可能还有另一份拷贝。另一个应用场景就是癌症基因组的somatic genotyping。肿瘤组织、cfDNA、ctDNA、CTC genotyping的结果中会包含正常的allele(与正常体细胞一致)、突变的allele，其中突变allele所占的比例就是VAF。VAF可以用于推断肿瘤的异质性和肿瘤纯度，此外VAF的高低可能会影响癌症的预后。

次等位基因频率(Minor Allele Frequency, MAF)，是群体遗传学中的概念，是指群体中丰度次高(第二高)allele的频率。在1000个人的群体中，某个位点有3种碱基类型：A、T、G。其中A碱基的频率是0.7，T碱基频率0.5，G碱基频率0.2，那么次等位基因频率指的就是T碱基的频率0.5。MAF可以用来区分某个allele是常见的多态性还是罕见的变异。

随着人类年龄的增长，由于有丝分裂错误和DNA损伤，造血干细胞的DNA会发生体细胞突变。突变所赋予的选择性生长优势会导致特定细胞谱系的扩展，该现象被称为克隆性造血(clonal haematopoiesis)。克隆性造血与特定血细胞谱系扩展相关，同时也与衰老以及健康情况相关，比如与血液系统肿瘤、心血管疾病等风险增加有关。

潜能未定性克隆造血(Clonal haematopoiesis of indeterminate potential，CHIP)是指成年人中的一种与年龄相关的无症状疾病，存在骨髓和/或外周血来源的突变，但血细胞并没有减少，也不满足髓系肿瘤的评判标准。大部分的患者良性病程，而克隆性造血中最常见的突变基因如DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D和TP53，会使其存在转换为恶性血液肿瘤的风险。除癌症外，CHIP还与心血管疾病相关，包括心肌梗死、中风和心力衰竭。

同年，ACMG发布了一项声明：关于在临床外显子组和基因组测序中报告次要发现的建议(2021年更新)。

临床实践中次要发现的频率：1~6%。

次要发现与人群携带者筛查的比较：ACMG明确表示，ACMG SF基因列表未经过一般人群筛查的验证。ACMG支持围绕人群筛查项目中需要考虑的因素(如外显率和基因型-表型相关性)继续开展研究和讨论，以便明确在无症状个体中使用此类基因组筛查的有效性。因此，ACMG设立了两个新的工作组，即无症状患者基因组筛查工作组(Genomic Screening of Asymptomatic Patients working Group)和人群筛查工作组(Population Screening working Group)。本政策声明的其余部分与SF有关。

纳入SF列表的标准：

临床表现：存在在高发病率或死亡率。症状和体征的出现是急性的，在症状或体征出现前，个体可能不知道这种风险。目前已有预防措施和/或治疗，携带致病变异的个体可能长期无症状。发病时间可在儿童和/或成人。
较高的发病率和/或死亡率，和/或早期发现可降低长期死亡率的疾病；
具有较高外显率；
可采取医疗干预(例如，药物或手术干预、监测)。但是本研究未考虑干预费用和患者可及性。

次要发现SF基因列表的评估程序

同年，ACMG指南更新——临床全外显子组和全基因组测序次要发现报告的政策声明(ACMG SF v3.0)。本次更新给出了ACMG SF v3.0列表。

ACMG次要发现工作小组(SFWG)的总体目标是在ES/GS进行时，尽可能减少患者和临床实验室的过度负担，同时最大限度地降低发病率和死亡率。

具有常染色体隐性遗传表型的基因需要两个致病/可能致(P/LP)变异(或存在纯合变异)需要报告。
报告与X连锁表型相关基因的P/LP变异，这些表型明确为半合子(hemi)、杂合子(het)、复合杂合子或纯合子。
在任何基因中都不应报告临床意义未明的变异。

ACMG SF v3.0列表中共有73个基因

心血管表型相关的基因

心血管基因从一开始就被列入SF列表，因为心脏性猝死(sudden cardiac death, SCD)和心力衰竭(heart failure, HF)的发病率和死亡率较高，而这两种疾病都可以通过成熟的干预措施来治疗或预防。

导致先兆晕厥、晕厥和SCD的原发性心律失常通常出现在离子通道病所包含的基因中。在已知风险的情况下，使用抗心律失常药或植入型心律转复除颤器(implantable cardioverter defifibrillators, ICD)可大大降低SCD风险和发病率。心肌疾病属于心肌疾病，也可引起致死性心律失常。心肌疾病也会导致心力衰竭，心力衰竭本身是一种病态和致命的状况，但这是一种非常适合医疗和器械治疗的疾病。考虑到这些，SFWG审查了心血管基因提名的证据，特别侧重于潜在SF的医疗可操作性、给定基因的外显率和表现度，以及还会考虑到可能会给提供者和临床实验室带来的潜在负担。

FLNC基因中的致病/可能致病(P/LP)变异会显著增加个体患扩张型心肌病和致心律失常性心肌病的风险，通常首先表现为心脏性猝死。基于该基因的高外显率、不治疗其表型的严重性、进行干预之后产生的潜在的极大益处，SFWG投票赞成将该基因纳入SF列表。

TTN基因是人类基因组中最大的单基因，长期以来一直被认为与扩张型心肌病相关。携带P/LP的TTN基因变异患者的临床干预可以为其及家属带来极大的益处。然而，该基因太长且具有高变异度，这使得对其外显率的评估不是那么容易，同时TTN基因变异的解读对临床实验室和临床医生的挑战。出于这些考虑，之前SFWG考虑过TTN基因，但最终并未被纳入。然而，自从上一次指南的迭代以来，大群体队列的外显率和表达度的新数据使得SFWG有必要重新考虑该基因。这些新证据表明，携带TTN基因截短变异的个体患心肌病的风险会大大地增加，尤其是对于那些携带处于高度表达外显子中TTN基因截短变异的个体来说风险更大。此外，TTN基因截短变异的频率(占总人群的0.5~1%)远低于TTN基因中的错义变异，因此鉴定和报告TTN基因截短变异是有必要的，并且评估其基因对临床实验室的负担是有限。因此，SFWG投票将TTN基因纳入在最新的SF列表中，并且只有TTN截短变异才会报告。

CASQ2基因的致病变异与常染色体隐性遗传的儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia, CPVT)相关，该病通常出现在儿童或青少年时期。与其他形式的CPVT一样，其临床表现以运动中猝死为先兆。在其他方面，患者静息期无症状，心脏成像显示心脏结构正常。运动平板试验引起典型的多形性室性心律失常特征的CPVT。其治疗是非常有效的，无论是以抗心律失常药物治疗的形式，或在某些情况下植入ICD。但在未被发现携带致病变异之前，对患者通常是致命的。因此，SFWG投票将CASQ2基因P/LP变异(检出反式位置的变异，或纯合变异)纳入SF列表。

TRDN基因与常染色体隐性遗传的CPVT或非典型长QT综合征相关，这取决于静息心电图的表现。常见的临床表现是发病年龄早(<10岁)的运动性心脏性猝死。在某些情况下，骨骼肌病的证据与心脏表现异常并存。早期发现这种情况可以进行适当的干预，如抗心律失常治疗或植入ICD。考虑到该疾病的早发性、致死性，SFWG投票将TRDN基因(检出反式位置的变异，或纯合变异）纳入SF列表。

先天性代谢异常(inborn errors of metabolism, IEM)相关基因

评估IEM时SFWG首先考虑是否纳入RUSP(the Recommended Uniform Screening Panel)建议的基因和疾病。RUSP的新生儿疾病筛查(Newborn Screening, NBS)由美国卫生部推荐。

BTD基因的致病性变异会引起生物素缺乏征。在未确诊但有患病风险的老年病例中，相当一部分临床症状比较严重，酶法检测验证容易，终身口服生物素对治疗方便有效，所以建议纳入。

酸性α-葡萄糖苷酶(acidα-glucosidase, GAA)隐性致病变异会引起庞贝病(Pompe Disease)。2015年纳入RUSP，至2020年10月仅23个州和华盛顿特区对该疾病开展NBS，但NBS可能无法诊断晚发、症状较轻的疾病。鉴于FDA已批准有效的酶替代疗法(enzyme replacement therapy, ERT)，建议添加将GAA/Pompe添加至SF清单，以便于对未进行新生儿筛查的年长晚发病例进行检测。

因此，将IEM纳入SF列表时，需要考虑了以下因素: (1)青少年期发病或晚发型疾病，RUSP推荐疾病不包括晚发型疾病的早期诊断或发病前诊断; (2)晚发型疾病应具有高度的医学可操作性; (3)人群中有大量未确诊病例。

不建议添加到SF v3.0列表

与许多其他SF基因一样，大多数心血管基因缺乏基于人群外显率的评估，特别是那些来自未确定心血管表型的群体队列的基因。随着这类证据的不断积累，一些未被纳入的额外“观察名单”基因可能符合纳入标准，如与扩张型心肌病相关的基因(如BAG3、DES、RBM20、TNNC1基因)，有证据显示这些基因与已经包含在列表中的其他心肌病基因会引起类似或更高的发病率和死亡率。此外，CALM1、CALM2和CALM3这三个独立的基因编码相同的蛋白，目前有大量的证据支持它们的变异可能会导致新生儿期或幼儿期出现非典型长QT综合征，有时与发育迟缓和癫痫有关。由于这种疾病通常不会漏诊，而且这三个基因的变异在成人疾病表现中的作用尚不清楚，因此这些基因不建议添加到SF列表中。

2022年